Определение оксида азота и супероксид анион-радикал электронов парамагнитного резонанса от клеток с использованием спиновых ловушек

Я — Фредерик Дина, доцент кафедры фармакологии Университета штата Огайо. В данной демонстрации мы покажем метод детектирования оксида азота и супероксида в клетках с помощью ЭПР-спин-траппинга.

Активные формы кислорода и азота участвуют в развитии различных заболеваний, поэтому их обнаружение в биологических системах имеет первостепенное значение. В биологических системах применяется лишь несколько надежных методов обнаружения активных форм, однако их возможности ограничены специфичностью и чувствительностью. Для идентификации активных форм кислорода часто используется метод спинового захвата, который основан на реакции присоединения радикала к нитроспиновому ловушке или металлокомплексам с образованием стабильного спинового аддукта; последний может быть обнаружен с помощью электронной парамагнитной резонансной спектроскопии (ЭПР). Различные радикальные аддукты демонстрируют характерные спектры, которые позволяют идентифицировать генерируемые радикалы и предоставляют обширную информацию о природе и кинетике образования радикалов.

Синтаза оксида азота катализирует превращение L-аргинина в L-цитруллин с использованием N-A-D-P-H для выработки оксида азота. В условиях окислительного стресса NOS может переключиться с выработки оксида азота на образование суперпероксида в процессе, называемом рассопряжением, которое, как полагают, вызвано окислением гема или кофактора, который поддерживает синтез оксида азота. Регуляция оксида азота в биологических системах имеет важное значение, так как он играет критическую роль в клеточной сигнализации, что приводит к полезным физиологическим функциям, таким как вазодилатация, однако его избыточная выработка часто связана с воспалительными состояниями. Следовательно, определение содержания оксида азота в биологических системах имеет большое значение.

Другим важным классом сигнальных молекул в биологических системах являются активные формы кислорода, такие как оксид азота; в низких концентрациях активные формы кислорода играют важную роль в регуляции функций клеток, передаче сигналов и иммунном ответе, однако при неконтролируемых концентрациях они могут вызвать окислительное повреждение клеток, приводящее к окислительному стрессу. Супероксид-радикал-анион является одной из наиболее значимых активных форм кислорода и основным предшественником некоторых из самых сильных окислителей, существующих в биологических системах, таких как пероксинитрит и гидроксильный радикал. Таким образом, обнаружение и/или секвестрация супероксида в биологических системах имеют большое значение, поскольку его появление служит первым признаком окислительного взрыва перед его началом.

В данном протоколе проводится трипсинизация культивируемых эндотелиальных клеток аорты быка, как описано в письменной процедуре. Перенесите клетки в маркированный шестилуночный планшет и инкубируйте в течение ночи при 37 °C и 5% CO2.

Извлеките планшет на шесть лунок из инкубатора и аспирируйте среду из первой лунки. Дважды промойте клетки одним миллилитром фосфатно-солевого буфера с декстрозой или DPBS. Приготовьте 1,9 мМ раствор гексагидрата сульфата железа, добавив 0,8 мг сульфата железа в один миллилитр DPBS с хлоридом кальция и хлоридом магния.

Приготовьте раствор MGD, добавив 2,7 мг MGD аммония к 500 µL DPBS с хлоридом кальция и хлоридом магния. Добавьте 210 µL свежеприготовленного 1,9 мM семиводного сульфата железа и 210 µL свежеприготовленного MGD, соблюдая молярное соотношение один к семи, и перемешайте полученную суспензию. Добавьте 4,6 µL ионов кальция и снова перемешайте раствор, используя метод пипетирования (вверх-вниз).

Затем инкубируйте образец при 37 °C в течение 36 минут. Соберите супернатант в эпиендорф-пробирку. Введите параметры сбора данных ЭПР: центральное поле 3427 G, амплитуду модуляции 6 G и частоту 9,8 GHz.

Поскольку параметры могут варьироваться в зависимости от прибора и условий эксперимента, пожалуйста, ознакомьтесь с текстом для уточнения других параметров, используемых при работе с данным оборудованием. Перенесите супернатант в плоскую кювету для ЭПР, герметизируйте ее парафином и поместите в резонатор ЭПР. После запуска эксперимента запишите спектры в течение примерно 21 минуты при 121 сканировании и времени сканирования 10.4 секунды на один скан.

Используйте программное обеспечение Bruker WIN EPR для коррекции базовой линии и интегрирования 2D-спектров, что позволяет снизить уровень фонового шума. Следует отметить, что время сканирования и количество сканов могут варьироваться от одного эксперимента к другому. Кроме того, методы коррекции базовой линии могут отличаться в зависимости от используемого программного обеспечения.

Для начала процесса разобщения eNOS удалите среду из второго лунки шестилуночного планшета и дважды промойте клетки 1 мл DPBS. Затем добавьте 100 µL приготовленного 0,5 мМ раствора Syn 1 и доведите объем до 2 мл с помощью DPBS, содержащего 10% FBS. Инкубируйте клетки в течение двух часов при 37 °C и 5% CO2; по завершении инкубации.

Дважды промойте клетки DPBS. Затем добавьте 210 µL свежеприготовленного 2,8 mM гидрата сульфата железа(II) и 210 µL 19,6 mM MGD, приготовленного свежим в соответствии с предыдущей процедурой. Далее добавьте 4,6 µL 1,9 mM ионов кальция и снова перемешайте раствор.

Как и ранее, инкубируйте клетки при 37 °C в течение 36 минут. Через 36 минут соберите супернатант, осевший в пробирке Эппендорфа, и перенесите его в плоскую кювету для ЭПР. Запишите ЭПР-спектры, используя те же параметры сбора данных, что и в предыдущий раз, после завершения регистрации.

Обработайте данные таким же образом до начала данного протокола. Приготовьте стоковый раствор 1 M DMPO и раствор PBS, содержащий 0,1 мM DTPA. Затем приготовьте раствор «four by 12» в концентрации 1 мг/мл.

Приготовьте аликвоты по 1 мл основного раствора PMA (миристат протеинкиназы С), разбавляя его в PBS до концентрации 10 µg/mL в пробирке Eppendorf, содержащей 1 mg/mL D-глюкозы и 1 mg/mL альбумина. С помощью пипетирования вверх-вниз в пробирке Eppendorf объемом 1,5 мл подготовьте суспензию PMN-клеток с концентрацией от 5 до 6 млн клеток/mL. Приготовьте смесь с конечным объемом 60 µL, содержащую примерно 1,6 × 10⁶ клеток PMN, 10 mM DMPO и 0,2 µg/mL PMA.

В данном эксперименте будет использован X-диапазонный спектрометр Bruker ESP 300. Перенесите раствор в плоскую ячейку для ЭПР, затем поместите ячейку в резонатор ЭПР. Установите следующие параметры сбора данных ЭПР: центр поля 3,486 goss, амплитуда модуляции 0,5 goss и частота 9.8 gigahertz.

Поскольку параметры будут различаться в зависимости от прибора и условий эксперимента, пожалуйста, ознакомьтесь с текстом для уточнения остальных параметров, использованных в данном эксперименте по регистрации спектров. В этой демонстрации мы показываем определение оксида азота и супероксидных радикалов с использованием двух различных спин-ловушек: Fe-MGD и DNPO.

Мы демонстрируем, что стимуляция эндотелиальных клеток ионами кальция приводит к выработке оксида азота, и что обработка донором азотистого вещества может снизить выработку оксида азота. Однако стимуляция нейтрофилов PMA в присутствии спиновой ловушки дает гидроксильный радикал ADDA вместо S-оксида из-за нестабильности первоначально образовавшегося супероксида adda. Хотя механизмы спинового захвата с помощью iron mg d нитрозо принципиально одинаковы, присоединение оксида азота к iron MGD характеризуется высокой скоростью реакции, а форма аддукта оксида азота с iron MGD является очень стабильной.

На самом деле, раствор можно заморозить при температуре -80 °C для последующего получения ЭПР-спектра без значительного снижения интенсивности ЭПР-сигнала. С другой стороны, обнаружение оксида с использованием нитро-спинового ловушки происходит медленно. Это требует более высоких концентраций спиновой ловушки по сравнению с аналогичным методом MGD 4 для обнаружения оксида азота.

Для успешного обнаружения аддукта супероксида применялись несколько подходов, которые мы более не демонстрируем в данном видео. Использование, например, кювет с плоским окном может обеспечить более высокую интенсивность сигнала аддукта супероксида за счет более высокой плотности клеток. Рекомендую обратиться к текстовым материалам по этому вопросу.

Кроме того, вместо использования DMPO можно применять сертифицированные спиновые ловушки, такие как BMPO и VMP, или фосфорилированный Nitro DAP MPO, которые позволяют получать более стабильные аддукты пероксида SU. Для стабилизации аддуктов пероксида SU при использовании спинового захвата для детектирования US также применяли циклодекстрин. Настоятельно рекомендуется незамедлительно регистрировать ЭПР-спектр после генерации супероксида SU.

Таким образом, детектирование оксида азота с помощью железного MGD происходит гораздо эффективнее, и основной проблемой, стоящей сейчас перед спиновым захватом супероксида методом ЭПР, является достижение тех характеристик, которые наблюдались при образовании аддукта оксида азота с железным MGD. А именно — высокая реакционная способность по отношению к супероксиду и стабильность аддукта. В настоящее время в нашей лаборатории, а также в других группах ведется работа по разработке спиновых ловушек с высокой скоростью реакции с супероксидом и способностью образовывать стабильные спиновые аддукты.