Определение оксида азота и супероксид анион-радикал электронов парамагнитного резонанса от клеток с использованием спиновых ловушек

Я Фредерик Дина, доцент кафедры фармакологии Университета штата Огайо. В данной демонстрации мы покажем метод детекции оксида азота и супероксида в клетках с помощью ЭПР-спин-траппинга.

Активные формы кислорода и азота участвуют в развитии различных заболеваний, поэтому их обнаружение в биологических системах имеет первостепенное значение. В биологических системах применялось лишь несколько надежных методов обнаружения активных форм, однако их возможности ограничены специфичностью и чувствительностью. Тем не менее, для идентификации активных форм кислорода часто используется метод спинового захвата, который основан на реакции присоединения радикала к нитроспиновому ловушке или металлокомплексам с образованием стабильного спинового аддукта, который может быть обнаружен с помощью электронной парамагнитного резонанса (ЭПР). Различные радикальные аддукты демонстрируют характерные спектры, которые позволяют идентифицировать генерируемые радикалы и предоставляют большой объем информации о природе и кинетике образования радикалов.

Нитрикидсинтаза катализирует превращение L-аргинина в L-цитруллин с использованием N-A-D-P-H для получения оксида азота. В условиях окислительного стресса фермент может переключиться с выработки оксида азота на выработку супероксида в процессе, называемом рассогласованием (uncoupling), который, как полагают, вызван окислением гема или кофактора, поддерживающего регуляцию оксида азота. Регуляция оксида азота в биологических системах имеет важное значение, так как он играет критическую роль в клеточной сигнализации, что приводит к благоприятным физиологическим функциям, таким как вазодилатация, однако его избыточная выработка часто связана с воспалительными процессами. Следовательно, определение уровня оксида азота в биологических системах имеет большое значение.

Еще одним важным классом сигнальных молекул в биологических системах являются активные формы кислорода, такие как оксид азота; в низких концентрациях активные формы кислорода играют важную роль в регуляции функций клеток, передаче сигналов и иммунном ответе, однако при нерегулируемых концентрациях они могут вызвать окислительное повреждение клеток, приводящее к окислительному стрессу. Супероксид-радикал-анион является одной из наиболее значимых активных форм кислорода и основным предшественником некоторых из самых сильных окислителей, существующих в биологических системах, таких как пероксинитрит и гидроксильный радикал. Таким образом, обнаружение и/или секвестрация супероксида в биологических системах имеют большое значение, так как его образование является первым признаком начала окислительного взрыва.

Данный протокол описывает трипсинизацию культивируемых эндотелиальных клеток аорты быка, как изложено в письменной процедуре. Перенесите клетки в маркированный шестилуночный планшет и инкубируйте в течение ночи при 37 °C и 5% CO2 после инкубации.

Извлеките 6-луночный планшет из инкубатора и аспирируйте среду из первой лунки. Дважды промойте клетки 1 mL фосфатно-солевого буфера с декстрозой (DPBS). Приготовьте 1,9 мM раствор гептагидрата сульфата железа, добавив 0,8 мг сульфата железа в 1 mL DPBS с хлоридом кальция и хлоридом магния.

Приготовьте раствор MGD, добавив 2.7 mg MGD аммония к 500 µL DPBS с хлоридом кальция и хлоридом магния. Добавьте 210 µL свежеприготовленного 1.9 mM семиводного сульфата железа и 210 µL свежеприготовленного MGD, используя молярное соотношение один к семи, и перемешайте полученную суспензию. Добавьте 4.6 µL ионов кальция IV и снова перемешайте раствор, несколько раз пропипетировав его.

Затем инкубируйте образец при 37 °C в течение 36 минут. Соберите супернатант в пробирку типа Эппендорф. Введите параметры сбора данных ЭПР: центрирование поля 3427 G, амплитуда модуляции 6 G и частота 9,8 GHz.

Поскольку параметры будут различаться в зависимости от прибора и условий эксперимента, пожалуйста, ознакомьтесь с текстом для уточнения других параметров, используемых в данном оборудовании. Перенесите супернатант в плоскую кювету для ЭПР, загерметизируйте ее парафином и поместите в резонатор ЭПР. Запишите спектры в течение примерно 21 минут при 121 сканировании и 10.4 секунд на одно сканирование после запуска эксперимента.

Используйте программное обеспечение Bruker WIN EPR для коррекции базовой линии и интегрирования 2D-спектров, что позволяет снизить уровень фонового шума. Следует отметить, что время сканирования и количество сканов могут варьироваться от одного эксперимента к другому. Также методы коррекции базовой линии могут различаться в зависимости от используемого программного обеспечения.

Для начала разобщения Enos удалите среду из второй лунки шестилуночного планшета и дважды промойте клетки 1 mL DPBS. Затем добавьте 100 µL приготовленного 0,5 mM раствора Syn one и доведите объем до 2 mL с помощью DPBS, содержащего 10% FBS. Инкубируйте клетки в течение двух часов при 37 °C и 5% CO2; после инкубации.

Дважды промойте клетки раствором DPBS. Затем добавьте 210 µL свежеприготовленного 2.8 мМ раствора сульфата железа (II) гептагидрата и 210 µL 19.6 мМ раствора MGD, приготовленного свежим согласно предыдущей процедуре. Далее добавьте 4.6 µL 1.9 мМ раствора ионов кальция и снова перемешайте раствор.

Как и прежде, инкубируйте клетки при 37 °C в течение 36 минут. По истечении 36 минут соберите супернатант, осевший в микроцентрифужной пробирке, и перенесите его в плоскую кювету для ЭПР. Запишите спектры ЭПР, используя те же параметры регистрации, что и при предыдущем измерении.

Обработайте данные аналогичным образом перед началом данного протокола. Приготовьте стоковый раствор 1 M DMPO и PBS, содержащий 0,1 mM DTPA. Затем приготовьте раствор 1 mg/mL 4-by-12.

Приготовьте аликвоты по 1 мл стокового раствора PMA (миристоин ацетат), разводя его в PBS до концентрации 10 µg/mL в пробирке типа Eppendorf, содержащей 1 mg/mL D-глюкозы и 1 mg/mL альбумина. Подготовьте суспензию PMN-клеток с концентрацией от 5 до 6 млн клеток/мл, аккуратно перемешивая их путем пипетирования в пробирке типа Eppendorf объемом 1,5 мл. Приготовьте смесь с конечным объемом 60 µL, содержащую приблизительно 1,6 × 10⁶ клеток PMN, 10 mM DMPO и 0,2 µg/mL PMA.

В данном эксперименте будет использован X-диапазонный спектрометр Bruker ESP 300. Перенесите раствор в плоскую кювету для ЭПР, затем поместите кювету в резонатор ЭПР. Установите следующие параметры сбора данных ЭПР: центральное поле 3,486 goss, амплитуда модуляции 0,5 goss и частота 9.8 gigahertz.

Поскольку параметры будут различаться в зависимости от прибора и условий эксперимента, пожалуйста, ознакомьтесь с текстом для уточнения остальных параметров, использованных в данном эксперименте по получению спектров. В этой демонстрации мы показываем детектирование оксида азота и супероксидных радикалов с использованием двух различных спиновых ловушек: MGD железа и DNPO.

Мы демонстрируем, что стимуляция эндотелиальных клеток ионами кальция вызывает выработку оксида азота, а воздействие донора перинитрита может снизить ее уровень. Однако стимуляция нейтрофилов PMA в присутствии спинового ловушки нитроспина приводит к образованию гидроксильного радикала ADDA вместо S-оксида из-за нестабильности первоначально образованного супероксида adda. Хотя механизмы спинового захвата с помощью iron mg d nitros принципиально одинаковы, присоединение оксида азота к iron MGD характеризуется высокой скоростью реакции, а образующийся аддукт iron MGD и оксида азота является очень стабильным.

На самом деле, раствор можно заморозить при температуре -80 °C для последующего получения ЭПР-спектра без значительного снижения интенсивности ЭПР-сигнала. С другой стороны, детектирование оксида с использованием нитро-спинового ловушки происходит медленно. Это требует более высоких концентраций спиновой ловушки по сравнению с аналогичным использованием MGD 4 для детектирования оксида азота.

Для успешного обнаружения формы аддукта супероксида были использованы несколько подходов, которые мы больше не демонстрируем в данном видео. Использование плоской кюветы, например, может обеспечить более высокую интенсивность сигнала аддукта супероксида за счет более высокой плотности клеток. Рекомендую вам обратиться к тексту по этому вопросу.

Кроме того, вместо использования DMPO можно применять сертифицированные спиновые ловушки, такие как BMPO и VMP, или фосфорилированный Nitro DAP MPO, которые могут давать более стабильные аддукты с супероксидом. Для стабилизации аддуктов супероксида при использовании метода спинового захвата для детекции супероксида также применялся циклодекстрин. Настоятельно рекомендуется проводить регистрацию ЭПР-спектра сразу после генерации супероксида.

Таким образом, детектирование оксида азота с помощью железного MGD проходит гораздо эффективнее, и основной проблемой, с которой сейчас сталкивается ЭПР-спин-траппинг супероксида, является достижение тех характеристик, которые наблюдались при образовании аддукта оксида азота с железным MGD. А именно: высокой реакционной способности по отношению к супероксиду и стабильности аддукта. В настоящее время в нашей лаборатории, а также в других группах, ведутся разработки спин-ловушек с высокой реакционной способностью к супероксиду и способностью образовывать стабильные спиновые аддукты.