Количественная оценка Белки Использование пептидов обогащению иммуноаффинной В сочетании с масс-спектрометрии

Общая цель следующей процедуры заключается в выделении и количественном определении пептидов в сложной смеси, которые действуют как суррогаты соответствующего белка. Сначала крупные белки в смеси расщепляются до составляющих пептидов с помощью фермента, такого как трипсин. Затем целевые пептидные аналиты и меченый спайковым стабильным изотопом внутренний стандарт обогащают антип-пептидными антителами, иммобилизованными на магнитных частицах, кодируемых белком G, после выделения.

Целевые пептиды выделяются из магнитных частиц и анализируются с помощью масс-спектрометрии для количественного определения относительно внутреннего стандарта. Основные преимущества этого метода по сравнению с существующими методами, такими как традиционные иммунологические анализы, заключаются в том, что он быстрее и экономичнее при создании большого количества анализов. Он имеет высокий процент успеха и легко мультиплексируется, демонстрируя схему процедуры.

Лаборант в лаборатории нагружает 10 микролитров плазмы Eloqua на мокрый лед. Переложите образец в луночный планшет глубиной 1000 микролитров и накройте пленкой-притчей для денатурации белков в дозе 20 микролитров свежей девятимолярной мочевины 30 миллимолярных DTT на каждый образец и инкубируйте в течение 30 минут при температуре 37 градусов Цельсия, добавьте три микролитра свежего 500 миллимолярного ацетамида I в каждый образец и инкубируйте в течение 30 минут в темноте при комнатной температуре. Теперь разведите мочевину до 0,6 моляра со 100 миллимолярами при pH 8, добавьте 10 микролитров по одному микрограмму на микролитр трипа и исходный раствор для соотношения ферментов к субстрату один к 50.

После инкубации реакции при 37 градусах Цельсия в течение ночи при трех микролитрах чистой муравьиной кислоты до конечной концентрации 1% продолжают добавлять стандарт стабильного изотопа или несколько стандартов. При проведении мультиплексного анализа хорошо промойте картриджную пластину Oasis 500 микролитрами 0,1% муравьиной кислоты в 80% нитриле ACE, отбросив поток. Затем уравновесьте пластину картриджа, добавив 500 микролитров 0,1% муравьиной кислоты в воду, и выбросьте сквозной поток.

Загрузите образцы дайджеста на пластину картриджа и отрегулируйте вакуум так, чтобы поток был очень медленным. Промойте три раза 500 микролитрами 0,1%-ной муравьиной кислоты в воде и отбросьте поток через элюирование пептидов дважды 500 микролитрами 0,1%-ной муравьиной кислоты в испытании 80%-ной кислотой, затем лиофилизируйте или ускорьте восстановление элюата до сухости и восстановите высушенные пептиды в 50 микролитрах PBS плюс 0,03%-е. Переведите образцы в стандартную 96-луночную пластину Kingfisher, добавьте один микрограмм антител и 1,5 микролитра белка G. Кодированные магнитные шарики на мишень. Сделайте бусины вихревыми перед добавлением.

Для того, чтобы бусины хорошо подвешивались. Накройте пластину фольгой и выдерживайте в течение ночи с помощью щадящей галтовочной центрифуги. Пластина при 400 об/мин в течение 10 секунд удаляет жидкость с поверхности фольги.

Снимите крышку из фольги. Манипуляции с образцами происходят на автоматизированной платформе Kingfisher на платформе Kingfisher. Дважды промойте шарики с 200 микролитрами PBS плюс 0,03% чапов и один раз 200 микролитрами разбавления от одного к 10 PBS плюс 0,03% Грапы теперь ускользают от пептидов с 25 микролитрами 5% уксусной кислоты плюс 0,03% чап.

Поместите элюирующую пластину на магнит и перенесите элюат на 96-луночную пластину, стараясь не перенести остатки шариков. Накройте пластину потолочным ковриком, поднесите эту пластину с элюатом к тройному, четырехкратному масс-спектрометру для анализа. Метод МРМ построен путем получения тандемного масс-спектра интересующего пептида, а не выбора и оптимизации наилучших ионов переходных фрагментов.

Как правило, в конфигурации для анализа MRM используется ловушка C 18 и аналитические колонны с двумя подвижными фазами. Загрузите 10 микролитров образца и вынимайте линейным градиентом. Интегрируйте пиковые площади для легких и тяжелых пептидов и рассчитайте отношение пиковых площадей немеченого и меченого пептидов в каждом образце.

Легкий и тяжелый пептиды элюируются одновременно, и для каждого пептида можно контролировать множественные переходы Для подтверждения идентичности измеряют пиковую площадь эндогенного пептида относительно площади внутреннего стандарта, чтобы обеспечить количественное измерение целевого пептида. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как внедрить эту методику в своей лаборатории. Его можно использовать для количественного определения любого интересующего белка, что делает его пригодным для широкого спектра применений в биологических исследованиях.