Конкурентные Геномная Экраны Barcoded Библиотеки дрожжей

Общая цель следующего эксперимента заключается в использовании полногеномных баркодированных коллекций микробов для изучения взаимодействий между генами и лекарственными препаратами, а также между генами и окружающей средой высокопараллельным методом. Это достигается путем скрининга коллекции микробов в течение от пяти до 20 поколений роста в присутствии препарата с использованием робототехники для поддержания клеток в фазе экспоненциального роста. На втором этапе осуществляется сбор клеток, что позволяет одновременно экстрагировать геномную ДНК из 4 000–6 000 отдельных особей.

Затем продукты ПЦР, содержащие амплифицированные штрихкоды, количественно определяют с помощью либо гибридизации на микрочипах, либо секвенирования штрихкодов, чтобы оценить их количество и таким образом определить обилие каждого штамма в сложном пуле. В итоге получаются результаты, показывающие, какие штрихкодированные мутанты чувствительны к воздействиям и, следовательно, вымываются из пула в ходе эксперимента. Главным преимуществом метода, который мы сегодня рассмотрим, является то, что вместо работы с каждым штаммом по отдельности в виде колоний на чашках или в индивидуальных жидких культурах, мы можем объединить десятки или сотни тысяч различных штаммов и анализировать их как один общий пул.

Осознав эффективность этого анализа, мы задались целью его автоматизировать; к счастью, я работал в центре Stanford Genome Technology sensor в окружении инженеров, что позволило мне реализовать эту задачу. Сегодня протокол продемонстрирует Эндрю Смит, старший аспирант моей лаборатории, который подробно опишет все этапы и сопутствующие процедуры, а также Таня Дурик, которая покажет, как выполнять секвенирование в рамках данного протокола. В этом протоколе используется библиотека мутантов *Candida albicans*, созданная с помощью транспозонного мутагенеза, где каждый мутант имеет штрихкод-метку для объединения отдельных мутантов в общий пул. Копия библиотеки реплицируется в 3-84.

Планшеты с питательной средой, в которых растут колонии, инкубируют при 30 °C в течение двух-трех дней до достижения ими максимального размера. Затем, работая в условиях микробиологической стерильности с использованием горелки и стерильной лабораторной посуды, каждый планшет заливают 5–10 мл среды и вымачивают в течение пяти минут. Колонии ресуспендируют с помощью клеточного шпателя, после чего жидкость вместе с клетками переливают в коническую центрифужную пробирку объемом 50 мл.

Добавьте DMSO до концентрации 7%. Доведите плотность культуры клеток до конечного значения OD 600, равного 50 на миллилитр, используя среду, содержащую 7% DMSO, затем разлейте по аликвотам объемом 40 мкл в стрипы ПЦР-пробирок; объединенные аликвоты клеток можно хранить неограниченно долго при температуре −80 °C. Чтобы начать выполнение данной процедуры, разморозьте объединенные аликвоты клеток на льду, затем осторожно разбавьте смесь в среде с выбранным препаратом или в заданных условиях, инокулируя клетки до OD 600, равного 0,0625, в общем объеме 700 мкл на лунку в 48-луночном планшете. Для целей данного видео будут подготовлены трипликаты для двух условий.

Добавьте на планшет хотя бы один соответствующий контроль с растворителем. Герметизируйте планшет пластиковой sealing-пленкой; культивируйте клетки в спектрофотометре или на шейкере с контролем температуры при 30 °C, используя экспериментально определенный режим перемешивания. Например, перемешивание в течение 14 минут, считывание лунок в течение одной минуты, затем возобновление перемешивания.

Часть клеточной суспензии может быть собрана роботом и сохранена на охлаждающей пластине на платформе робота. Сбор производят в определенные пользователем моменты времени генерации, обычно через 5, 10, 15 и 20 генераций роста. Для каждого образца и временной точки необходимо собрать клетки с плотностью не менее 2 od 600.

Перенесите собранные образцы клеток в микроцентрифужные пробирки с безопасным замком. Эти клетки можно использовать для экстракции геномной ДНК; данный процесс будет продемонстрирован далее для начала этой процедуры. Очищенная геномная ДНК из клеток, собранных в разные моменты времени с помощью набора yeast star kit.

Согласно инструкциям производителя с одной модификацией, элюируйте ДНК 300 µL 0,1 XTE. Затем подготовьте две ПЦР-реакции для каждого образца: одну для UPT-меток и одну для down-меток.

Проверьте полученные ПЦР-продукты с помощью гель-электрофореза. Для ампликонов, используемых для гибридизации, ожидается продукт размером 60 оснований, что показано в дорожках один и три. В данном примере для ампликонов, предназначенных для секвенирования штрих-кодов, ожидается продукт размером 130 оснований, что показано в дорожках пять и семь.

На данном этапе продукты ПЦР можно использовать либо для микрочипового анализа, либо для прямого секвенирования штрихкодов, в зависимости от того, какой продукт ПЦР был получен. Для подготовки к микрочиповому анализу предварительно нагрейте гибридизационный oven до 42 °C, подготовьте водяную баню с кипящей водой и емкость со смесью льда и воды. Предварительно увлажните чипы, медленно добавив 120 µL 1х гибридизационного буфера (hybridization Buffer).

Инкубируйте массивы в буфере для гибридизации при 42 °C и 20 об/мин в течение 10 минут. Пока массивы инкубируются, подготовьте пробирки с фиксированной крышкой объемом 0,5 мл, налив в каждую по 120 µL буфера для гибридизации. Подготовьте пробирку для каждого образца плюс одну дополнительную в качестве контроля. Добавьте в смесь для гибридизации 30 µL продукта ПЦР с апстрим-меткой и 30 µL продукта ПЦР с даунстрим-меткой, чтобы общий объем составил 150 µL.

Кипятите в течение двух минут, затем поместите в ледяную воду минимум на две минуты. Перед использованием проциркулируйте пробирки в центрифуге в течение короткого времени. Удалите буфер для прегибридизации с массивов и добавьте 120 µl смеси для ПЦР-гибридизации, чтобы предотвратить испарение.

Накройте прокладки микрочипа плотными пятнами (tough spots), проведите гибридизацию в течение 16 часов при температуре 42 °C и скорости 20 об/мин. Извлеките микрочипы из печи для гибридизации и снимите плотные пятна с чипов. Медленно удалите смесь для гибридизации с микрочипов с помощью пипетки и заполните микрочипы.

Загрузите массивы в промывочную систему подготовленной жидкостной станции, используя 120 µL промывочного раствора A. Промывка массивов будет осуществляться по протоколу gene Flex SV 3 4 50 со следующими модификациями: перед окрашиванием добавить один дополнительный этап промывки раствором A.

Промывка B при температуре 42 °C вместо 40 °C и окрашивание при 42 °C на гидравлической станции вместо 25 °C. После завершения гидравлических операций запустите гидравлическую станцию и выключите протокол «four 50». Выгрузите промывочную станцию, предварительно убедившись в отсутствии пузырьков воздуха.

Поместите массивы в сканер и выполните сканирование при длине волны испускания 560 нанометров. ПЦР-продукт длиной 130 пар оснований используется для секвенирования штрих-кодов следующего поколения; для этого сначала разделите 12 пулов образцов ДНК на 12%-ном геле. Затем окрасьте гель красителем Cyber Green и вырежьте интересующую полосу геля.

Количество ДНК, выделенной из геля, затем определяют методом ПЦР в реальном времени, после чего генерируют кластеры на одной ячейке считывания, используя CBOT и набор для генерации кластеров при одиночном считывании. Установите ячейку считывания в секвенатор и проследите за выходом первого основания. Секвенатор, показанный здесь, является репрезентативным; данные были собраны на определенных этапах протокола.

Пул меченых мутантов культивировали в течение 20 поколений в присутствии противогрибкового средства clotrimazole и в DMSO в качестве контроля; для каждого гена был рассчитан и построен график отношения log2. Все штаммы, проявляющие значительную чувствительность к воздействию clotrimazole с отношением log2, равным двум, выделены красным цветом. В данном примере показаны четыре штамма: NCP1, ERG2 и два независимых аллеля ERG11.

Чувствительность известных белковых мишеней противогрибкового препарата клотримазола у штаммов, определенных как чувствительные в ходе пула-скрининга, должна быть подтверждена в индивидуальных тестах на рост в присутствии той же концентрации препарата. На следующем графике представлены результаты подтверждающего эксперимента. У четырех штаммов, выявленных в ходе скрининга, наблюдалось снижение роста по сравнению с родительским штаммом дикого типа.

BWP 17 отмечен черным цветом. Эти индивидуальные кривые роста подчеркивают важную особенность подобных пулевых скринингов генных препаратов: абсолютный ранг конкретного штамма не обязательно отражает точный уровень его чувствительности. Кроме того, результаты демонстрируют ценность использования нескольких аллелей для каждого гена.

В данном случае два мутанта с нарушением функции ERG 11 обладают несколько различающейся чувствительностью к препарату. При должном исполнении и освоении данной техники весь процесс — от инокуляции для скрининга до анализа данных — может занять пять дней. Таким образом, хотя каждый отдельный эксперимент дает важную биологическую информацию, истинная ценность метода проявляется при проведении большого количества экспериментов и создании базы данных, которая позволит прогнозировать функцию генов и механизм действия лекарственных средств.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как подготавливать коллекции геномных баркодированных мутантов для пулл-скрининга, а также о том, как использовать микрочипы или секвенирование для идентификации интересующих генов после завершения анализа. Данный метод позволил исследователям в области функциональной геномики изучить функции каждого из 6 000 различных генов в геноме дрожжей.