Единый Drosophila Омматидия Препарирование и обработка изображений
19 августа 2011 г.
Ограничивающим фактором в использовании взрослых Drosophila Глаза на исследование нейродегенерации и клеточной биологии трудно визуализации внутриклеточных процессов. Мы описываем вскрытия одного омматидии генерировать добросовестных первичной культуры клеток нейронов, которые могут быть предметом лечения наркозависимости и Advanced Imaging.
Общая цель данной процедуры заключается в препарировании и визуализации отдельных особей drosophila или matia для изучения внутриклеточных событий в моделях нейродегенерации. Это достигается путем отделения головы мухи от остальной части тела с последующим вскрытием.
Затем из головы извлекают мозг и другие ткани. После этого удаляют кутикулу, и каждую сетчатку разрезают пополам. Заключительным этапом процедуры является вырезание O с помощью вольфрамовой иглы и помещение их на предметное стекло.
В конечном итоге с помощью флуоресцентной конфокальной микроскопии можно получить результаты, демонстрирующие цитоплазматические аутофагические органеллы. Основным преимуществом данного метода является возможность проведения высокоразрешающего цитобиологического анализа на моделях нейродегенерации у drosophila, которые до настоящего времени позволяли получать в этой области только генетические данные, что доказывает вариативность процедуры. Работу выполнял аспирант моей лаборатории при помощи Дэниела Макея, специалиста по гистологии и микроскопии центра.
Для начала наполните одну лунку стеклянного предметного стекла с тремя лунками фосфатно-солевым буферным раствором, затем анестезируйте мух углекислым газом. После того как мухи будут анестезированы, захватите одну муху пинцетом и поместите ее в небольшую емкость с PBS. Под диссекционным микроскопом зажмите хоботок пинцетом, а затем отделите голову от тела, перерезав шейный отдел.
Используя второй пинцет для удержания головы мухи за хоботок, разрежьте голову пополам вдоль латеральной ростральной срединной линии микроножницами. Чтобы обнажить мозг, используйте обрезанный наконечник пипетки, чтобы захватить голову, закрепить сетчатку и перенести её в другую лунку, заполненную средой Шнайдера. Пинцетом удалите большую часть кутикулы головы, а затем извлеките мозг.
Удерживайте сетчатку зажатой между ламиной и роговицей. Затем перенесите сетчатку в каплю свежей среды Шнайдера объемом 50 µL. Поместив ее непосредственно на предметное стекло, захватите пинцетом либо дорсальный, либо вентральный конец сетчатки, используя микроножницы.
Разрежьте сетчатку пополам вдоль дорсовентральной срединной линии, чтобы обнажить AMIA в центре глаза. Продолжайте удерживать сетчатку так, чтобы роговица была обращена вниз, а ламина — вверх. С помощью тонкой вольфрамовой иглы отделите oia сначала от ламины, а затем от роговицы.
Одиночные OIA и группы OIA будут собираться на дне лунки или предметного стекла. Перед продолжением удалите любые более крупные скопления детрита, которые могли накопиться. Для анализа аутофагии разведите LysoTracker в пропорции 1:1000 в капле среды Шнайдера, перемешайте и подождите 10 секунд.
Удалите излишки жидкости со стекла, стараясь не смыть AMIA. Добавьте каплю Vector Shield, чтобы покрыть AMIA.
Накройте образец покровным стеклом и загерметизируйте его бесцветным лаком для ногтей. С помощью конфокальной микроскопии в отдельном тегментуме, выделенном из мухи, экспрессирующей мутантную форму Atropin, можно визуализировать как автофагосомы, маркированные GFP-ATG8, так и лизосомы, маркированные LysoTracker. На панели в светлом поле в верхнем правом углу видна почти неповрежденная структура тегментума, а рамка указывает область сканирования. Здесь красным цветом обозначены лизосомы, а зеленым — автофагосомы.
Автолизосомы, образующиеся в результате слияния двух органелл, выглядят желтыми. После выполнения данной процедуры могут быть применены другие методы, такие как культивирование материала и введение препаратов, для решения различных задач. Например, для изучения влияния эффективных соединений на маркеры аутофагии в нейронных клетках с различным генетическим фоном.
Сочетание преимуществ генетики дрозофилы с передовыми методами клеточного биологического анализа, которые возможны при использовании клеточных культур.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье описывается процедура диссекции и визуализации отдельных омматидиев Drosophila для изучения внутриклеточных процессов в моделях нейродегенерации. Этот метод позволяет создавать первичные культуры нейрональных клеток, которые можно подвергать воздействию лекарственных препаратов и применять к ним передовые методы визуализации.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Клеточная биология
- Нейродегенерация
Теоретические основы
- Визуализация внутриклеточных процессов у взрослых особей Drosophila представляет собой сложную задачу.
- Диссекция отдельных омматидиев позволяет изучать клеточные механизмы.
- Первичные культуры нейронов обеспечивают возможность воздействия препаратами и применения передовых методов визуализации.
- Данный подход расширяет понимание процессов нейродегенерации.
Цель исследования
- Для препарирования омматидиев Drosophila с целью клеточного анализа.
- Для облегчения визуализации внутриклеточных процессов.
- Для создания платформы для исследований по воздействию лекарственных препаратов.
Используемые методы
- Закрепите голову мухи и рассеките ее.
- Удалите мозг и другие внутренние ткани.
- После удаления кутикулы разрежьте сетчатку пополам.
- С помощью вольфрамовой иглы выделите омматидии и перенесите их на предметное стекло.
Основные результаты
- Успешное выделение отдельных омматидий.
- Создание полноценных первичных культур нейрональных клеток.
- Возможность проведения фармакологического воздействия на культивируемые клетки.
- Применение передовых методов визуализации для изучения внутриклеточных процессов.
Выводы
- Данный метод является ценным инструментом для изучения нейродегенерации.
- Диссекция одиночных омматидиев расширяет возможности визуализации клеток.
- Этот подход может привести к новым открытиям в области нейробиологии.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Диссекция и визуализация отдельного омматидия у Drosophila позволяют проводить анализ внутриклеточных событий, связанных с нейродегенерацией, с высоким разрешением, преодолевая ограничения, вызванные аутофлуоресценцией всего глаза. Данный метод способствует механическому снижению рисков и валидации мишеней на ранних этапах поиска лекарств, позволяя напрямую визуализировать процессы аутофагии и ответы на препараты в генетически определенных нейронных клетках. Возможность адаптации метода для прижизненной визуализации и введения соединений делает его универсальной платформой для исследовательских циклов по изучению нейродегенерации.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Позволяет проводить прямой анализ аутофагии и внутриклеточного транспорта в нейронах, имеющих значение для изучения заболеваний.
- Обеспечивает функциональную валидацию мишеней путем визуализации субклеточных ответов на генетические или фармакологические воздействия.
- Способствует механистическому снижению рисков за счет дифференциации клеточно-автономных эффектов в мозаичных генетических фонах.
Скрининг и разработка анализа
- Предлагает валидированную систему ex vivo для количественной визуализации аутофагических и лизосомальных маркеров.
- Обеспечивает воспроизводимую подготовку образцов отдельных клеток для стандартизированного тестирования соединений.
- Поддерживает масштабируемость анализа и повторное использование платформы для скрининга агентов, модифицирующих нейродегенерацию.
Трансляционные и доклинические исследования
- Соответствует патогенетическим путям заболевания за счет моделирования нарушений аутофагии в генетически доступной системе.
- Обеспечивает преемственность от генетических открытий до доклинической оценки соединений в нейрональных клетках.
- Поддерживает минимизацию рисков при разработке за счет предоставления прогностических клеточных показателей для мишеней нейродегенерации.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод связывает этап ранних открытий с доклиническими исследованиями, позволяя проводить проверку гипотез о внутриклеточных механизмах и эффектах соединений в генетически определенном нейрональном контексте.
- Открывающая биология: позволяет проверять гипотезы о путях аутофагии и нейродегенерации в отдельных омматидиях.
- Скрининг: обеспечивает количественные, воспроизводимые результаты визуализации для оценки соединений.
- Аналитика: предоставляет измерения аутофагосом, лизосом и продуктов их слияния на основе конфокальной микроскопии.
- Трансляционные исследования: способствует приведению клеточных фенотипов в соответствие с моделями заболеваний и разработкой биомаркеров.
- Корпоративное повторное использование: предлагает модульную платформу, адаптируемую к различным генетическим фонам и библиотекам соединений.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает прогностическую достоверность при валидации мишеней и изучении механизмов нейродегенерации.
- Операционная ценность: Стандартизирует рабочие процессы выделения единичных клеток и визуализации для обеспечения воспроизводимости и масштабируемости.
- Стратегическая ценность: Улучшает процесс принятия решений о продолжении или прекращении разработки («go/no-go»), предоставляя прямые клеточные доказательства взаимодействия с мишенью и эффективности соединений.
- Влияние на портфель: Позволяет проводить приоритизацию мишеней нейродегенерации и терапевтических кандидатов с учетом рисков.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области диссекции Drosophila и методах конфокальной визуализации.
- Необходим доступ к флуоресцентной микроскопии и инфраструктуре для культивирования клеток.
- Требуется межкомандная стандартизация протоколов подготовки образцов и визуализации.
- Метод адаптируем к различным генетическим фонам с использованием методов мозаичного анализа.
- Ограничено анализом ex vivo; для обеспечения трансляционной преемственности может потребоваться валидация in vivo.
