Развитие сотового типа конкретных анти-ВИЧ gp120 аптамеры для доставки миРНК

Общая цель следующих экспериментов заключается в получении РНК-аптимеров in vitro для белка GP120 ВИЧ-1 с использованием нитроцеллюлозной мембраны. Это достигается путем ПЦР и последующей транскрипции in vitro с помощью T7-РНК-полимеразы. Для подготовки исходной ДНК и рандомизированной библиотеки РНК на втором этапе смесь целевого белка и библиотеки РНК наносят на предварительно увлажненный нитроцеллюлозный фильтр, что позволяет изолировать связавшиеся молекулы РНК от несвязавшихся фракций РНК.

После 12 циклов селекции библиотека РНК клонируется и секвенируется для идентификации отдельных кандидатов в аптимеры из библиотеки. По результатам анализа сдвига электрофоретической подвижности и конфокальной микроскопии выявлено несколько новых аптимеров с наномолярным сродством. Основное преимущество данного метода перед существующими способами, такими как использование битинов или колоночная изоляция, заключается в простоте и отсутствии необходимости в предварительной подготовке белка или библиотек, например, в иммобилизации белка на подложке. Библиотека РНК для выделения РНК-аптимеров к анти-ВИЧ GP120 подготавливается из коммерчески синтезированной библиотеки ДНК, содержащей 50 нуклеотидов случайных последовательностей.

Последовательность библиотеки одноцепочечных ДНК-олигонуклеотидов имеет длину 81 нуклеотид. Как показано на данной схеме, рандомная область фланкирована константными областями: A 30 tumor на 5'-конце и 16 MA на 3'-конце. Константные области включают промотор T7 для транскрипции in vitro и 3'-тег для RT-PCR.

Проведите амплификацию одноцепочечной ДНК-олигонуклеотидной рандомизированной библиотеки с помощью ПЦР, ограничив количество циклов до 10, чтобы сохранить репрезентативность исходной библиотеки ДНК. После проведения ПЦР двухцепочечный пул амплифицированной ДНК выделяют с помощью набора для очистки из геля. Затем двухцепочечную ДНК превращают в РНК-библиотеку с использованием набора cript в соответствии с инструкциями производителя; при этом в реакционной смеси для транскрипции CTP и UTP заменяют на два фторпиримидина, CTP и два фторпиримидина UTP, для получения РНК, устойчивой к действию рибонуклеаз.

По завершении реакций транскрипции обработайте реакционные смеси ферментом DS one для удаления матричной ДНК и очистите их с помощью 8% полиакриламидного геля с 7 М мочевиной. В завершение количественно определите очищенную библиотеку РНК с помощью УФ-спектрофотометрии. Перед отбором оптимальных вариантов подготовьте необходимые буферы и храните их при соответствующих температурах.

Буфер Heaps при комнатной температуре, а буферы для рефолдинга РНК и связывания РНК при -20 °C. Перед началом первого цикла селекции предварительно инкубируйте пул рандомных РНК на предварительно увлажненном нитроцеллюлозном фильтре при комнатной температуре в течение 30 минут, чтобы минимизировать неспецифическое связывание с фильтром. Через 30 минут удалите нитроцеллюлозный фильтр.

Смешайте предварительно очищенный пул случайных РНК и белок HIV one bowel GP one 20 в буфере для связывания РНК с низкой ионной силой, затем инкубируйте смесь на ротаторе при комнатной температуре в течение 30 минут. Далее пропустите реакционную смесь через предварительно увлажненный нитроцеллюлозный фильтр и промойте его 1 мл буфера для связывания РНК с низкой ионной силой, чтобы элюировать связавшуюся РНК с фильтра. Извлеките нитроцеллюлозную мембрану из держателя фильтра.

Добавьте 200 µL буфера для элюции на мембрану и нагревайте при 95 °C в течение пяти минут. После элюирования РНК с фильтра кратковременно центрифугируйте пробирку, перенесите раствор РНК в новую пробирку и проведите фенол-хлороформную экстракцию полученного элюата. Используйте колонку MicroCon YM 30 для концентрирования РНК и элюируйте выделенную РНК 20 µL воды, свободной от РНКаз.

Затем полученный пул РНК подвергают обратной транскрипции и амплифицируют в течение 15 циклов ПЦР. После очистки амплифицированного двухцепочечного пула его транскрибируют в новый пул РНК, как было продемонстрировано ранее, перед следующим раундом селекции. Проведите рефолдинг пула РНК в одном объеме буфера HBS: нагрейте до 95 °C в течение трех минут, а затем медленно охладите до 37 °C.

Продолжите инкубацию при 37 °C в течение 10 минут. Адсорбируйте рефолдированную РНК, пропустив её через нитроцеллюлозный фильтр в течение 30 минут перед инкубацией с целевым белком GP120 ВИЧ для следующего раунда селекции. Для успешного получения аптамеров с более высоким сродством к связыванию необходимо тщательно контролировать строгость селекции путем регулировки условий отбора.

Условия селекции представлены в данной таблице. Для раундов селекции на Cellex с первого по четвертый инкубируйте предварительно очищенный пул РНК с целевым белком в буфере для связывания РНК с низкой концентрацией солей в течение 30 минут. После четвертого раунда селекции на Cellex по мере продолжения процесса используйте буфер для связывания РНК с высокой концентрацией солей.

Уменьшите количество белка GP120 и увеличьте количество конкурирующей дрожжевой тРНК, чтобы повысить строгость селекции аптамеров в каждом цикле. Ход селекции аптамеров к GP120 ВИЧ-1 контролируют с помощью анализа связывания на фильтре. В данном видео будет проведен анализ 12 пулов РНК, собранных после всех циклов селекции.

Сначала удалите инициирующий пятипраймовый трифосфат, обработав каждый пул РНК щелочной фосфатазой кишечника теленка в течение одного часа при 37 °C. Чтобы подготовить РНК, обработанную CIP, для мечения с помощью T4-полинуклеотидкиназы и P³² 80 p, нагрейте ее при 95 °C в течение пяти минут, после чего охладите на льду. Мечение РНК проводится в «горячей комнате», предназначенной для экспериментов с радиоактивными веществами, с использованием буфера PNK, T4-полинуклеотидкиназы, 1 µL γ-P³² ATP и воды до общего объема 20 µL. Инкубируйте при 37 °C в течение 30 минут.

Через 30 минут добавьте по 20 µL воды в каждую реакционную смесь и проведите очистку с помощью колонки G 50. В итоге получите 40 µL меченой РНК с конечной концентрацией 250 nM; каждый пул меченой РНК в 1-кратном буфере HBS нагрейте до 95 °C в течение трех минут. После этого дайте образцам остыть до 37 °C, что займет от 30 до 40 минут.

Продолжайте инкубацию при 37 °C в течение 10 минут. После ренатурации пула РНК проведите реакцию связывания в объеме 100 µL. Смешайте меченый пул РНК с белком GP one 20 и десятикратным молярным избытком неспецифического конкурента ТРНК в буфере для связывания РНК с высокой ионной силой; инкубируйте при комнатной температуре в течение 30 минут.

По истечении 30 минут отберите 50 µL реакционной смеси для связывания с помощью предварительно увлажненного нитроцеллюлозного фильтра. Затем промойте фильтр двумя миллилитрами буфера для связывания и измерьте радиоактивность, удерживаемую на фильтре, с помощью универсального сцинтилляционного счетчика в качестве контрольного измерения входа. Оставшиеся 50 µL реакционной смеси для связывания в то же время были использованы для анализа связывания пула РНК после каждого цикла селекции с помощью анализа связывания на фильтрах с конкурирующей тРНК для мониторинга прогресса HIV-1 GP120.

Активность связывания при селекции Optima рассчитывалась как процент исходной РНК, удерживаемой на фильтре в составе белково-РНК-комплекса, как показано здесь. Исходный пул РНК демонстрирует удержание на мембране всего 0,1% исходной РНК. Однако после девяти раундов селекции девятая библиотека РНК имеет 9,72% связанной исходной РНК.

Несмотря на проведение дополнительных раундов селекции, дальнейшего обогащения не наблюдалось, что указывает на достижение максимального связывания пула РНК. Связывающая активность пулов РНК была дополнительно подтверждена с помощью анализа сдвига электрофоретической подвижности. Эти результаты демонстрируют, что в данных пулах РНК последовательно обогащаются лиганды с высокой специфичностью связывания с целевым белком.

В данном примере 12-й пул РНК продемонстрировал самую высокую связывающую активность, поскольку максимальное связывание пула РНК было достигнуто после 12-го раунда селекции; этот пул РНК был подвергнут обратной транскрипции в кДНК, которая впоследствии была амплифицирована с помощью ПЦР. Затем продукт ПЦР был очищен, клонирован в вектор для TA-клонирования и секвенирован после выравнивания 140 клонов. Были идентифицированы шесть групп оптимальных анти-GP120.

В данной таблице указаны только случайные последовательности основных регионов Aptima. Около 40% клонов содержат консервативную последовательность. Для дальнейшей характеристики была выбрана по одной репрезентативной последовательности из каждой группы на основании их относительной распространенности в группе, определенной с помощью анализа сдвига подвижности в нативном геле; для этих репрезентативных аптамеров была рассчитана константа диссоциации KD, например, для A1.

Лучший из антител имеет кажущееся значение KD 52 nanomolar. Как показано здесь. Эти отобранные антитела могут селективно связываться с целевым белком HIV-1 gp120, но не с белком H-I-V-G-P-1-20-CM. Для проверки связывания и интернализации отобранных анти-gp120 оптимальных вариантов были использованы клетки CHO G160, стабильно экспрессирующие гликопротеин оболочки HIV gp160.

Эти клетки не перерабатывают GP160 в GP120 и GP41, так как в них отсутствуют протеазы, кодируемые геном gag, которые необходимы для процессинга оболочки. Анализ методом проточной цитометрии показал, что аптамеры, меченные S3, специфически связываются с клетками CHO GP160, но не с контрольными клетками CHO EE, которые не экспрессируют GP160. Кроме того, конфокальная микроскопия живых клеток в режиме реального времени с Z-стеком показала, что после двух часов инкубации аптамеры, меченные S3, селективно интернализируются клетками CHO GP160, но не контрольными клетками CHO EE. Также было замечено, что аптамеры агрегируют в цитоплазме, что позволяет предположить, что аптамер к GP120 может проникать в клетки посредством рецептор-опосредованного эндоцитоза.

Наконец, после просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как использовать полевые методы измерения для выделения РНК.