Эффективное доставки генов в нескольких территориях ЦНС Использование In Utero Электропорация

Общая цель этой процедуры заключается в изменении экспрессии генов в центральной нервной системе эмбриона нейрона. Это достигается путем предварительного получения беременных самок и подготовки их к операции. Затем рога матки обнажаются путем создания разреза на брюшной полости.

После того, как эмбрионы обнажаются, ДНК вводится в боковой желудочек, третий желудочек или субретинальное пространство. Заключительным этапом процедуры является подача электрического тока на эмбрион через стенку матки, ориентируя лопастные электроды таким образом, чтобы положительный полюс располагался над предпочтительным местом трансфекции. В конечном счете, могут быть получены результаты, которые показывают пролиферацию, миграцию и дифференцировку нейропредшественников в умирающем келоне и сетчатке с помощью иммунофлуоресцентной микроскопии.

Основное преимущество этой техники или существующих методов, таких как дегенерация трансгенных мышей, заключается в том, что она быстра, позволяет проводить исследования с более высокой пропускной способностью и имеет меньшую стоимость. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области развития нейронов, такие как какие гены регулируют нейронный предшественник, пролиферацию клеток, спецификацию судьбы клеток, дифференцировку нейронов и миграцию клеток. Применение этого метода может быть направлено на лучшее понимание генетических путей, которые подчеркивают дефекты в развитии ЦНС, многие из которых приводят к когнитивным нарушениям и являются поведенческими расстройствами у людей.

Этот метод также может быть применен к другим системам органов, таким как развивающаяся периферическая нервная система, сердце и плацента. Он также может быть применен для изучения моделей болезней у мышей, а также других модельных организмов, таких как цыпленок и ксип. Как правило, основным препятствием на пути к успеху для людей, плохо знакомых с этой техникой, является выживание эмбрионов.

Впервые идея этого метода пришла нам в голову, когда нам понадобились быстрые средства для манипулирования экспрессией генов в эмбрионе, конечном мозге и сетчатке. Мы разработали этот метод в нашей лаборатории, модифицировав метод, первоначально описанный Салом и опубликованный в журнале Developmental Biology в 2001 году. Мы также работали с краш-лабораторией, чтобы внедрить этот протокол в разрабатываемый дилон.

Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, поскольку этапы инъекции и электропорации трудно освоить, потому что они требуют очень осторожных манипуляций с эмбрионами, а места инъекций иногда могут быть очень маленькими. Пример, субретинальное пространство Демонстрировать процедуру сегодня будет Раджив, постдок из лаборатории Шермана. Затем наполните шприцы физиологическим раствором и раствором лактата Рингера и поместите их на грелку, чтобы согреть в области операции.

Простерилизуйте грелку с 70% этанолом, а затем накройте ее стерилизованной марлевой салфеткой. Установите грелку на 37 градусов Цельсия. Поместите животное в небольшую анестезиологическую камеру и обезболите, подав 5%изофтора с кислородом со скоростью один литр в минуту через испаритель.

Обязательно собирайте изоф фтористых выхлопных газов с помощью системы очистки. Как только дыхание животного станет глубоким и ровным, выньте его из камеры. Используйте рефлексы щипания пальцев ног и моргания глаз.

Для обеспечения полноценной анестезии. Положите животное под наркозом на живот и с помощью респираторной трубки подайте 2,25% льда фтора во время операции. Вводите бупренорфин в концентрации 0,1 миллиграмм на килограмм массы тела подкожно в область затылка.

Продолжайте следить за дыханием животного и при необходимости отрегулируйте поступление изофтора. Затем обмотайте лентой грудь животного, находящегося под наркозом, и снова проверьте реакцию втягивания, зажав заднюю ногу тупыми щипцами. С помощью стерильного ватного тампона нанесите толстый слой крема на живот, убедившись, что нижняя шерсть полностью покрыта.

Оставьте крем примерно на три минуты и периодически проверяйте наличие эпиляции. С помощью стерильного тампона смочите стерильную марлевую салфетку стерильной водой и сотрите волосы с живота. Далее простерилизуйте место разреза хлоргексидином и большим количеством воды.

Высушите живот чистой стерильной марлей. Повторите этот шаг с 70% этанолом, используя свежую стерилизованную ватную марлю. Подготовьтесь к операции, надев хирургическую одежду, чтобы обнажить рога матки.

Сначала найдите линейную белую кость как слабую линию под кожей по средней линии С помощью щипцов оттяните кожу от брюшной стенки и разрежьте небольшой прямой разрез от середины живота вниз ножницами для кожи с помощью изогнутых щипцов и ножниц. Повторите процесс с брюшиной. Захватите брюшину щипцами.

Оттяните, а затем разрежьте разрез ровно настолько, чтобы протянуть матку. Наложите на разрез стерильную марлю с небольшой вертикальной щелью и смочите ее теплым стерильным физиологическим раствором. Затем вставьте щипцы в разрез и найдите матку, держа разрез открытым с помощью щипцов.

Захватите матку между первым и вторым видимыми эмбрионами и натяните на марлю обе стороны маточных рогов. Посчитайте количество эмбрионов, отмечая любую резорбцию или эмбрионы с маленьким размером тела. Для того чтобы подготовить правильное количество инъекций ДНК, смочите рога матки физиологическим раствором и осторожно верните один маточный рог в брюшную полость.

Чтобы испытывать отвращение к хирургическим иглам, используйте вытянутую вверх пипетку с прикрепленным мундштуком, чтобы набрать 10 микролитров по три миллиграмма на миллилитр. Раствор ДНК не содержит эндотоксина, содержащий метилзеленый краситель и выводит ДНК в хирургическую иглу. Установите первую заполненную иглу на микроманипулятор.

Встаньте прикрепленным к инжектору, начиная с эмбриона, ближайшего к яичнику. С помощью циркулярных щипцов аккуратно переверните эмбрион внутри децидуальной кости так, чтобы он располагался лицом вперед, позволяя делать инъекции в виде рулона АФК в кордальном направлении. Использование оптоволоконного источника света для определения средней линии эмбрионального мозга.

Обратите внимание на фланкированные большие боковые желудочки в ростральных областях. Удерживайте эмбрион на месте с помощью изогнутых щипцов и расположите заполненную хирургическую иглу над маткой так, чтобы угол входа в мозг составлял примерно 45 градусов. Быстрым и устойчивым движением поверните диск на микроманипуляторе, чтобы ввести кончик иглы через стенку матки в боковой желудочек эмбрионального мозга.

Далее нажмите на подушечку лапки микроинжектора. Для введения раствора ДНК успешная инъекция легко визуализируется путем распространения метилового зеленого красителя по желудочкам эмбрионального мозга. Теперь, когда ДНК была введена, медленно втяните иглу обратно, чтобы удалить ее, не вызвав поломки.

Поместите введенный эмбрион на стерильную марлю и тщательно смочите теплым физиологическим раствором. Захватите матку положительным полюсом лопастного электрода, помещенного над желаемым местом трансфекции. Затем подайте пять квадратных электрических импульсов напряжением от 40 до 50 вольт и 50 миллисекунд с частотой один импульс в секунду.

Накройте введенный и электрозаряженный эмбрион защитной влажной марлей, а затем продолжайте вводить следующий эмбрион. По завершении инъекции и электроимплантации всех желаемых эмбрионов в маточный рог, осторожно протолкните его обратно в полость тела. Удалите второй маточный рог, чтобы начать инъекцию и электропорацию оставшихся эмбрионов.

Как только все эмбрионы вернутся внутрь матки, добавьте два-три миллилитра теплого физиологического раствора в брюшную полость, а затем снимите марлю с брюшной полости, чтобы открыть стороны брюшины. Используйте черную плетеную шелковую леску, чтобы зашить брюшину, закрепив линию на брюшине, ближайшей к грудине, и продолжая стежок в сторону от анкера. Убедитесь, что все швы плотно затянуты и что в брюшину не вшиты никакие подлежащие органы или кожа.

Обрежьте оставшуюся линию шва и выбросьте. Натяните кожу на линию шва щипцами с помощью скоб, закрывающих кожу. Обрежьте кожу, стараясь не сшивать линию шва под ней и не натягивать кожу слишком туго.

После завершения убедитесь, что скобы плотно закреплены, аккуратно надавливая на него с помощью инструмента для наложения швов, два вектора экспрессии A-P-C-I-G, управляющие экспрессией GFP, были электропорированы в развивающуюся неокортекс в точке E 12. По мере развития неокортекса апикальные предшественники дифференцируются либо во вторичные базальные предшественники, либо в постмитотические нейроны и продолжают экспрессировать GFP. Затем эти нервные клетки могут быть проанализированы на экспрессию типичных маркеров нейронного подтипа, показанного красным цветом.

На этом продажном изображении переднего мозга эмбриона, электропорированного в точке Е 12 и рассеченного в точке Е 14, электропорированный участок обозначен зеленой эпифлуоресценцией в точке Е 14. Экспрессия GFP наблюдается в таламусе, преталамусе и гипоталамусе, что указывает на успешную трансфекцию отмирающих территорий LIC. Приборная панель отмечает расположение разреза через одну желудочковую зону.

Более пристальный взгляд на желудочковую зону показывает миграцию клеток GFP из желудочковой зоны в мантийную зону. Там, где формируются ядра гипоталамуса, эмбриональная сетчатка также легко электропорируется, как показано на этом корональном разрезе, через E 16.5 I электропорируется PCIC в точке E 15.5. В этом случае накопление m вишневых положительных клеток специфично для внешнего слоя нейробластов и не наблюдается у B rrn трех B положительных ганглиозных клеток сетчатки в слое ганглиозных клеток.

Пытаясь провести эту процедуру, важно использовать надлежащие стерильные методы, твердую руку при манипуляциях с эмбрионами и иметь все необходимые материалы наготове, прежде чем вводить беременную женщину под наркоз. После этой процедуры эмбрионы с электроплетением могут быть допущены к жизни до взрослого возраста, после чего могут быть выполнены другие методы, такие как поведенческие и функциональные анализы, чтобы ответить на дополнительные вопросы, касающиеся того, как манипуляции с определенными генами в эмбрионе влияют на функцию нейронов у взрослого человека. С момента своего развития этот метод проложил путь исследователям в области развития ЦНС к изучению функции генов in vivo у мышей.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как внедрить чужеродную ДНК в эмбриональную нервную трубку. В частности, мы покажем вам, как подготовить беременную самку к операции. Обнажите матку, введите ДНК и электролит эмбриона.

Не забывайте, что работа с изофтором может быть опасной, и при выполнении этой процедуры следует соблюдать меры предосторожности, такие как система очистки.