Органоидная модель опухоли мочевого пузыря: метод ортотопической трансплантации органоидов мочевого пузыря в мышиный мочевой пузырь реципиента

Опухолевые органоиды, полученные от пациента, представляют собой миниатюрные опухоли, развившиеся из родительского органа. При трансплантации в животную модель эти органоиды сохраняют большую часть фенотипических и генетических характеристик исходной опухоли, что позволяет проводить персонализированную терапию рака. Например, органоиды рака мочевого пузыря имеют положительный окрас на многие клеточные маркеры в качестве соответствующей родительской опухоли.

Чтобы разработать модель опухолевого органоида, начните с культивирования органоидов опухоли мочевого пузыря. Добавьте в органоидную культуру суспензию фермента коллагеназы и инкубируйте. Коллагеназа расщепляет компоненты матрикса. Теперь добавьте предварительно подогретую питательную среду, чтобы высвободить свободные органоиды в суспензии. Центрифуга при низкой температуре, чтобы нейтрализовать любую остаточную активность коллагеназы и получить органоидную гранулу.

Выбросьте надосадочную жидкость, содержащую нейтрализованные ферменты и деградировавшие компоненты матрицы, и повторно суспендируйте гранулу в свежей среде. Перенесите органоидную суспензию в питательную среду, содержащую матрицу базальной мембраны. Затем наберите органоид и суспензию среды в шприц и введите ее в переднюю стенку обнаженного пузыря мыши, подвергшегося хирургическому воздействию.

Сложная сеть матрицы базальной мембраны помогает захватить органоиды и облегчает их интеграцию со стенкой мочевого пузыря. Стенка мочевого пузыря имитирует микроокружение родительской опухоли, позволяя органоидам развиваться в опухоль, которая отражает морфологию и патогенез исходного рака.

Чтобы подготовить органоиды опухоли мочевого пузыря к ортотопической трансплантации, добавьте 500 микролитров коллагеназы/диспазы в органоидную среду в 24-луночный планшет. Пипеткой проведите матрицу базальной мембраны и среду вверх и вниз. Затем инкубируйте тарелку в течение 20 минут при температуре 37 градусов Цельсия.

После инкубации соберите клетки в 15-миллилитровую пробирку и добавьте 5 миллилитров предварительно подогретого DMEM. Затем центрифугируйте пробирку при давлении 400 х г в течение 3 минут при температуре 4 градуса Цельсия и отасуньте надосадочную жидкость. Повторно суспензируйте гранулу с 1 миллилитром DMEM и переложите раствор в 90-миллиметровую чашку Петри.

Под микроскопом соберите от 10 до 100 опухолевых органоидов с помощью пипетки P200 и соберите их в микропробирку на льду. Центрифугируйте микропробирку и осторожно удалите надосадочную жидкость. Затем держите гранулу на льду до тех пор, пока мыши не будут готовы к операции. Перед трансплантацией подслизистой стенки мочевого пузыря держите шприцы, наконечники пипеток и матрикс базальной мембраны на льду до тех пор, пока они не будут готовы к использованию.

После того, как мышь была обезболивана, уложите ее в лежачее положение и поддерживайте анестезию путем ингаляции маски с 2% испаренным изофлураном. Нанесите повидон-йод стерильной марлей и протрите ее 70% этанолом. Сделайте небольшой поперечный разрез на коже и мышечной стенке нижней средней линии живота стерильными хирургическими ножницами. Обнажите мочевой пузырь из брюшной полости и поддержите его ватным тампоном, смоченным в физрастворе.

Ресуспендируйте органоидные гранулы в 80 микролитрах органоидной среды, содержащей 50% матрицы базальной мембраны высокой концентрации, и введите суспензию в переднюю часть купола мочевого пузыря с помощью инсулинового шприца. Закройте разрез нейлоновым швом 4-0 и продезинфицируйте место операции повидон-йодом и 70% этанолом. Дайте мыши восстановиться под действием инфракрасного облучателя в течение 10–15 минут. Затем снова следите за мышью, пока она не придет в сознание.