Окрашивание внеклеточной ДНК: метод идентификации внеклеточной ДНК в срезах ткани FFPE

Умирающая клетка высвобождает часть ДНК за пределами клетки, называемую внеклеточной ДНК. Чтобы окрасить внеклеточную ДНК, начните со взятия фиксированного формалином парафина, или FFPE, среза ткани на предметном стекле. Нагрейте предметное стекло в течение желаемого времени. Это облегчает прикрепление ткани к поверхности предметного стекла и размягчает окружающий парафин.

Погрузите предметное стекло в жидкость для депарафинизации, чтобы полностью растворить слой парафина вокруг ткани. Затем окуните предметное стекло в уменьшающуюся концентрацию этанола, чтобы регидратировать депарафинизированную ткань. После регидратации погрузите предметное стекло в кипящий раствор для извлечения антигена. Эта процедура обнажает эпитопы, которые были изменены в процессе фиксации.

Наложите на предметное стекло первичные антитела и позвольте им связываться со специфическими незамаскированными эпитопами, присутствующими на клетке. Затем добавьте флуоресцентно помеченные вторичные антитела, которые связываются с первичными антителами. Окуните предметное стекло в раствор Sudan Black для уменьшения автофлуоресценции фона.

Наконец, нанесите каплю монтажного материала, дополненного DAPI, на участок ткани и запечатайте его покровным стеклом. Инкубируйте, чтобы молекулы DAPI окрашивали ДНК. Визуализируйте подготовленный срез ткани с помощью флуоресцентного микроскопа. Флуоресцентно меченые эпитопы в клетке помогают дифференцировать ядерную ДНК, присутствующую внутри клетки, от внеклеточной ДНК.

Для окрашивания внеклеточной ДНК сначала нагрейте интересующие образцы в штативе для слайдов при температуре 60 градусов Цельсия в течение 60 минут, а затем погрузите предметные стекла в две 40-минутные смены растворителя в вытяжном шкафу. После второго погружения дважды регидратируйте образцы в 100% этаноле и один раз в 70% этаноле в течение 5 минут за одну процедуру.

После последней обработки с помощью щипцов поместите предметные стекла в кипящий раствор для извлечения антигена в скороварке на высокой мощности на 10 минут. После демаскировки эпитопов антигена переведите скороварку с огня в раковину и сразу же прокачайте крышку холодной водой из-под крана.

Дайте предметным стеклам сбалансироваться в течение 20 минут в растворе для извлечения антигена, прежде чем промывать образцы два раза в 0,01 моляра PBS на орбитальном шейкере в течение 5 минут за промывку. После второго промывания с помощью гидрофобной ручки нарисуйте круги вокруг образцов ткани почек и блокируйте любое неспецифическое окрашивание 60 микролитрами 10% куриной сыворотки в 5% бычьем сывороточном альбумине в течение 30 минут при комнатной температуре.

В конце инкубации осторожно замените блокирующий раствор 60 микролитрами первичного антитела, представляющего интерес, в камере влажности на ночь при температуре 4 градуса Цельсия. На следующее утро промойте предметные стекла на орбитальном вибростенде в PBS в течение 2 минут за промывку, прежде чем добавить 60 микролитров соответствующего вторичного антитела, конъюгированного с флуорофором, в каждое стекло для 40-минутной инкубации при комнатной температуре.

В конце инкубации промойте предметные стекла в PBS, как показано на рисунке, с последующей обработкой в 0,3% Sudan Black в 70% этаноле для подавления любой потенциальной автофлуоресценции, вызванной формалином. Через 30 минут промойте слайды в водопроводной воде, чтобы удалить осадок, и погрузите слайды в PBS на 10 минут, чтобы предотвратить дальнейшее образование осадков Sudan Black.

В конце инкубации закрепите стекла на конфокальные стеклянные покровные стекла каплями монтажного раствора объемом 360 микролитров с добавлением DAPI и запечатайте покровные стекла лаком для ногтей. Дайте предметным стеклам застыть в течение 24 часов при комнатной температуре. Храните их при температуре 4 градуса Цельсия в защищенном от света месте до получения изображений с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии в соответствии со стандартными протоколами.