Получение почечных почечных почечных клеток человека из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток: процедура направленной дифференцировки зрелых почечных подоцитов из стволовых клеток

Зрелые клетки могут быть перепрограммированы на восстановление их недифференцированного и пролиферативного состояния, подобного стволовым клеткам. Эти перепрограммированные клетки называются индуцированными плюрипотентными стволовыми клетками или IPSC. Чтобы дифференцировать плюрипотентные клетки в подоциты – специализированные клетки, участвующие в фильтрации отходов из почек, начните с приема суспензии человеческих IPSC в индукционной среде мезодермы.

Перенесите эту суспензию на цокольную матрицу, покрытую питательной пластиной, и инкубируйте. Матрица основания облегчает адгезию IPSC в основании. Впоследствии специфические факторы, присутствующие в среде, индуцируют дифференцировку IPSC в клетки мезодермы, клетки-предшественники подоцитов. Отсасывайте отработанную среду.

Дополните планшет желаемым объемом промежуточной среды для индукции мезодермы и инкубируйте в течение длительного времени. Этот этап приводит к дифференцировке мезодермальных клеток в незрелые подоциты. Замените промежуточную среду для индукции мезодермы раствором трипсина, чтобы диссоциировать адгезивные клетки от пластины.

Далее центрифугу для гранулирования ячеек. Выбросьте надосадочную жидкость, содержащую раствор трипсина, и фрагменты матрицы. Ресуспендируйте гранулу в среду индукции подоцитов. Перенесите клеточную суспензию в свежую культуральную пластину, покрытую оболочкой. Инкубируйте для развития нескольких ступчатых выступов из промежуточных клеток, что приводит к образованию зрелых подоцитов.

После подсчета ресуспендировать клетки в соотношении 1 умножить на 10 к пятой клетке на миллилитр индукционной среды мезодермы и аспирировать раствор внеклеточного матрикса из 2-х покрытых пластин базальной мембраны. Дважды промойте планшеты теплой средой и смешайте индуцированную человеком суспензию плюрипотентных стволовых клеток с помощью щадящего пипетирования.

Добавьте по 1 миллилитру клеток в каждую лунку матрицы базальной мембраны с 2-слойным покрытием 12-луночных планшетов и осторожно встряхните пластины, чтобы распределить клетки более равномерно. Затем поместите планшет в инкубатор для клеточных культур. Со 2 по 15 день дифференцировки замените индукционную среду мезодермы 1 миллилитром промежуточной индукционной среды мезодермы на лунку.

Если наблюдается значительный рост клеток и быстрое истощение питательных веществ, о чем свидетельствует пожелтение среды, объем промежуточной среды для дифференцировки мезодермы может быть увеличен до 1,3 миллилитров на лунку. На 16-й день культивирования прополойте промежуточные клетки мезодермы теплой средой и инкубируйте клетки с 500 микролитрами 0,05% трипсина-ЭДТА на лунку в течение 3 минут при 37 градусах Цельсия.

Когда клетки начнут диссоциировать, соскребите клетки с помощью клеточного лифтера и аккуратно перемешайте клетки с помощью пипетирования. Остановите реакцию примерно 2 миллилитрами нейтрализующего раствора трипсина на лунку и переведите клетки в 50-миллилитровую коническую трубку. Доведите объем до 50 миллилитров со средой и соберите клетки методом центрифугирования.

Ресуспендировать пеллеты и среду индукции подоцитов в соотношении 1 умно-10 на пятые клетки на миллилитр средней концентрации и добавить клетки в матрицу базальной мембраны с 2-х покрытием пластин. Затем осторожно встряхните пластину, чтобы обеспечить более равномерное распределение клеток, и поместите клетки в инкубатор на срок до 5 дней.

• Induced Pluripotent Stem Cells (IPSCs) - Reprogrammed mature cells with a proliferative, undifferentiated state similar to stem cells.
• Podocytes - Specialized cells involved in the filtration of waste from kidneys.
• Mesoderm Cells - Precursor cells for podocytes that are derived from IPSCs.
• Mature Podocytes - Fully developed podocytes, characterized by several foot-like projections.
• Directed Differentiation - A process of driving the development of undifferentiated cells into a specific cell type.

• Introduce Induced Pluripotent Stem Cells (IPSCs) - Cells which can be reprogrammed to regain a stem cell-like state (e.g., pluripotent).
• Key Concepts - Summarization of the steps from IPSCs to mature podocytes (e.g., directed differentiation of IPSCs, kidney mesoderm).
• Underlying Mechanisms - This involves various elements, such as media induction, cell incubation, and resuspension (e.g., deriving).
• Connect to Experiment - Understanding of how this process is valuable in studying kidney functions (e.g., podocytes kidney, normal human kidney podocytes).

• What are Induced Pluripotent Stem Cells (IPSCs) and how are they reprogrammed?
• What are podocytes and how do they function in the kidney?
• What is the process of deriving podocytes from mesoderm cells?

• Practical Applications - Generation of podocytes could be used in testing pharmaceutical effects on kidneys (e.g., kidney podocytes).
• Industry Impact - The research may offer new treatments for kidney-related diseases (e.g., human podocytes).
• Societal Importance - A better understanding of the IPSCs may revolutionize regenerative medicine (e.g., pluripotent).
• Link to Scientific Advancements - The evolution of technology that could manipulate cell development (e.g., directed differentiation of ipsc).