Почему проверка нулевой гипотезы имеет значение для валидации дифференцировки подоцитов?

Проверка нулевой гипотезы необходима для определения того, обусловлены ли наблюдаемые изменения характеристик подоцитов протоколом дифференцировки или случайными вариациями, что обеспечивает надежную валидацию мишени в исследованиях почек.

Как изоляция независимой переменной вписывается в рабочие процессы дифференцировки иПСК в подоциты?

Изоляция таких переменных, как состав среды или время инкубации, позволяет исследовательским группам однозначно связать результаты дифференцировки с конкретными изменениями в протоколе, что улучшает оптимизацию на этапе поиска и воспроизводимость результатов.

Что позволяют количественные измерения подоцитов при проведении анализов на нефротоксичность?

Количественная оценка морфологии и жизнеспособности подоцитов позволяет объективно сравнивать эффекты соединений, что способствует принятию решений на основе данных при скрининге нефротоксичности и разработке методов анализа.

Почему требования к репликации имеют критическое значение для кросс-функциональных исследований подоцитов?

Воспроизводимость гарантирует, что дифференцировка подоцитов и результаты анализа остаются согласованными между различными группами и экспериментами, что способствует надежному обмену данными и совместным научно-исследовательским разработкам.

Какие возможности статистического анализа необходимы перед внедрением анализа подоцитов?

Для анализа эффективности дифференцировки, воспроизводимости анализа и эффектов воздействия требуются надежные статистические инструменты, гарантирующие, что данные, полученные на базе подоцитов, соответствуют стандартам корпоративных исследований и разработок (R&D) для принятия решений.

Получение почечных почечных почечных клеток человека из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток: процедура направленной дифференцировки зрелых почечных подоцитов из стволовых клеток

JoVE Encyclopedia of Experiments

Исследования рака

0 просмотров • 4:19 мин • April 30th, 2023

Зрелые клетки могут быть перепрограммированы на восстановление их недифференцированного и пролиферативного состояния, подобного стволовым клеткам. Эти перепрограммированные клетки называются индуцированными плюрипотентными стволовыми клетками или IPSC. Чтобы дифференцировать плюрипотентные клетки в подоциты – специализированные клетки, участвующие в фильтрации отходов из почек, начните с приема суспензии человеческих IPSC в индукционной среде мезодермы.

Перенесите эту суспензию на цокольную матрицу, покрытую питательной пластиной, и инкубируйте. Матрица основания облегчает адгезию IPSC в основании. Впоследствии специфические факторы, присутствующие в среде, индуцируют дифференцировку IPSC в клетки мезодермы, клетки-предшественники подоцитов. Отсасывайте отработанную среду.

Дополните планшет желаемым объемом промежуточной среды для индукции мезодермы и инкубируйте в течение длительного времени. Этот этап приводит к дифференцировке мезодермальных клеток в незрелые подоциты. Замените промежуточную среду для индукции мезодермы раствором трипсина, чтобы диссоциировать адгезивные клетки от пластины.

Далее центрифугу для гранулирования ячеек. Выбросьте надосадочную жидкость, содержащую раствор трипсина, и фрагменты матрицы. Ресуспендируйте гранулу в среду индукции подоцитов. Перенесите клеточную суспензию в свежую культуральную пластину, покрытую оболочкой. Инкубируйте для развития нескольких ступчатых выступов из промежуточных клеток, что приводит к образованию зрелых подоцитов.

После подсчета ресуспендировать клетки в соотношении 1 умножить на 10 к пятой клетке на миллилитр индукционной среды мезодермы и аспирировать раствор внеклеточного матрикса из 2-х покрытых пластин базальной мембраны. Дважды промойте планшеты теплой средой и смешайте индуцированную человеком суспензию плюрипотентных стволовых клеток с помощью щадящего пипетирования.

Добавьте по 1 миллилитру клеток в каждую лунку матрицы базальной мембраны с 2-слойным покрытием 12-луночных планшетов и осторожно встряхните пластины, чтобы распределить клетки более равномерно. Затем поместите планшет в инкубатор для клеточных культур. Со 2 по 15 день дифференцировки замените индукционную среду мезодермы 1 миллилитром промежуточной индукционной среды мезодермы на лунку.

Если наблюдается значительный рост клеток и быстрое истощение питательных веществ, о чем свидетельствует пожелтение среды, объем промежуточной среды для дифференцировки мезодермы может быть увеличен до 1,3 миллилитров на лунку. На 16-й день культивирования прополойте промежуточные клетки мезодермы теплой средой и инкубируйте клетки с 500 микролитрами 0,05% трипсина-ЭДТА на лунку в течение 3 минут при 37 градусах Цельсия.

Когда клетки начнут диссоциировать, соскребите клетки с помощью клеточного лифтера и аккуратно перемешайте клетки с помощью пипетирования. Остановите реакцию примерно 2 миллилитрами нейтрализующего раствора трипсина на лунку и переведите клетки в 50-миллилитровую коническую трубку. Доведите объем до 50 миллилитров со средой и соберите клетки методом центрифугирования.

Ресуспендировать пеллеты и среду индукции подоцитов в соотношении 1 умно-10 на пятые клетки на миллилитр средней концентрации и добавить клетки в матрицу базальной мембраны с 2-х покрытием пластин. Затем осторожно встряхните пластину, чтобы обеспечить более равномерное распределение клеток, и поместите клетки в инкубатор на срок до 5 дней.