Выделение гладкомышечных клеток Detrusor: процедура ферментативного пищеварения для получения клеток DSM из образцов мочевого пузыря человека

Гладкомышечные клетки детрузора, или DSM, присутствующие в стенке мочевого пузыря, составляют основную функциональную единицу мочевого пузыря. Эти клетки расслабляются, способствуя накоплению мочи в мочевом пузыре, и сокращаются, чтобы выпустить мочу.

Чтобы выделить клетки DSM, начните со взятия взятого образца мочевого пузыря человека. Промойте образец, чтобы удалить следы крови и мусора. Впоследствии закрепите ткань ее слизистой поверхностью вверх. Иссеките жир, кровеносные сосуды и слой слизистой, чтобы обнажить нижележащий детрузорный мышечный слой. Затем разрежьте свободную от слизистой ткани на мелкие фрагменты.

Обработайте фрагменты тканей коктейлем для пищеварения, содержащим папаин, и инкубируйте. Папаин, протеолитический фермент, способствует перевариванию белков во внеклеточном матриксе, которые удерживают клетки вместе, и инициирует ослабление клеток в матриксе. Теперь удалите патаин-содержащую надосадочную жидкость.

Добавьте к фрагментам ткани суспензию фермента коллагеназы и инкубируйте при физиологической температуре. Коллагеназа разрушает внеклеточный матрикс и способствует диссоциации клеток DSM. Инкубация при физиологической температуре помогает сохранить целостность клеток DSM. Откажитесь от надосадочной жидкости, содержащей коллагеназу.

Промойте фрагменты ткани ледяным буфером, чтобы удалить остатки ферментов. Затем снова подвесьте их в буфере. Осторожно растирайте обработанные ферментами фрагменты ткани, чтобы обеспечить полную диссоциацию любых неосвобожденных клеток и получить одноклеточную суспензию клеток DSM. Храните элементы DSM при низких температурах до дальнейшего использования.

Начните с осмотра образца мочевого пузыря по всей толщине. Приколите образец слизистой оболочкой вверх и серозой вниз на 150-миллиметровую круглую посуду с силиконовым энантиомером, наполненную ледяным DS, и осторожно удалите всю слизистую оболочку путем резкого рассечения.

Вырежьте несколько гладкой мускулатуры без слизистой оболочки или кусочки DSM. Поместите от 3 до 6 кусочков DSM в пробирку с 1-2 миллилитрами предварительно подогретого DS, содержащего папаин и дитиотреитол или DS-P. Инкубируйте их при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30–45 минут, встряхивая пробирку каждые 10–15 минут.

После инкубации извлеките DS-P из пробирки и кратковременно промойте кусочки DSM ледяным DSM. Перенесите DS с частями DSM в новую пробирку и извлеките DS, оставив части DSM на дне трубки. Добавьте в пробирку от 1 до 2 миллилитров DS, содержащего коллагеназу типа II или DS-C, и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия с периодическим встряхиванием.

Выбросьте DS-C и промойте обработанные ферментами кусочки DSM от 5 до 10 раз ледяным DS. После последней промывки оставьте DS внутри пробирки и аккуратно растирайте детали с помощью дозатора Пастера, отполированной огнем, чтобы освободить отдельные ячейки DSM.