JoVE Encyclopedia of Experiments
Исследования рака
0 просмотров • 3:35 мин • April 30th, 2023
В почках позвоночных нефроны состоят из множественных клубочков – плотной сети кровеносных сосудов, которые играют первостепенную роль в фильтрации отходов из организма.
Чтобы выделить клубочки, начните с забора свежерассеченной почки мыши. С помощью щипцов отклейте почечную капсулу от почки и поместите чистую почку в чашку для нового культивирования. Теперь положите тарелку на лед, чтобы избежать деградации почек. Измельчите почку на мелкие кусочки.
Далее суспендируйте измельченные кусочки почек в подходящем буферном растворе. Процедите тканевую суспензию через сетчатый фильтр большого размера и соберите проток в свежую посуду. Повторите этот шаг еще несколько раз, постепенно уменьшая размер ячеек каждый раз, пока клубочки не диссоциируют от фрагментов почек.
Наконец, промойте фильтр желаемой питательной средой, чтобы собрать более мелкие захваченные клубочки, в то время как фрагменты почек остаются в фильтрате. Переложите клубочки на сверхнизкую крепежную пластину. Визуализируйте пластину с помощью микроскопа с инвертированным светом.
С помощью микропипетки захватите один клубочек и перенесите его в свежую лунку. Дополните лунку питательными средами и используйте выделенный клубочек для дальнейшего анализа.
Освободив почки, как указано в рукописи текста, удерживайте почку хирургическими щипцами и используйте еще одну пару щипцов, чтобы оттянуть почечные капсулы. После этого поместите почки в лунки 6-луночного планшета, каждый из которых содержит 2 миллилитра HBSS, и поместите планшет для культивирования на лед.
Затем переложите почки в 100-миллиметровую чашку Петри и с помощью двух скальпелей измельчите их на небольшие кусочки, которые составляют примерно от 1 до 2 миллиметров. Держите кусочки фарша влажными с помощью HBSS.
Затем поместите кусочки почки на металлическое сито с температурой 300 микрометров и продавите почку через сито с помощью поршня из 20-миллилитрового шприца. Между ними несколько раз промойте сито с помощью HBSS и с помощью серологической пипетки соберите проточный поток и переложите его в чистую чашку Петри.
С помощью скальпеля соскребите все, что осталось на дне сита и перенесите это в собранный гомогенат почек. Промойте гомогенат почек через сито 75 и 53 микрометра с HBSS. Затем промойте оба сита с помощью HBSS, чтобы удалить все мелкие структуры.
Соберите почечные структуры и материал, оставшийся в ситах, промыв верхнюю поверхность каждого DMEM с добавлением 20% эмбриональной телячьей сыворотки, и перенесите материал в лунки 6-луночного микропланшета со сверхнизким прикреплением.
Поднесите микропланшет со сверхнизким уровнем крепления к микроскопу с инвертированным светом и с помощью пипетки объемом 20 микролитров соберите одиночные инкапсулированные и/или декапсулированные клубочки.