Выделение экзосом: метод ультрацентрифугирования на основе плотности с использованием подушки сахарозы для отделения экзосом от кондиционированных сред культивируемых клеток

Экзосомы – наноразмерные, связанные с мембраной везикулы, несущие функциональные биомолекулы – активно секретируются большинством типов клеток и могут быть выделены из супернатантов клеточных культур in vitro. Чтобы выделить экзосомы, сначала собирают надосадочную жидкость или кондиционированные среды из представляющей интерес клеточной культуры. Кондиционированная среда будет содержать экзосомы, белки, клеточный мусор и везикулы.

Центрифугируйте среду для гранулирования клеточного мусора. Соберите содержащую экзосому надосадочную жидкость и отфильтруйте ее через клеточные фильтры, чтобы удалить более крупные везикулы. Переложите определенный объем отфильтрованной среды в свежую пробирку. Далее смешайте соответствующие концентрации сахарозы и оксида дейтерия, чтобы получить подушку из сахарозы - прерывистый градиент сахарозы.

Добавьте определенный объем раствора сахарозы в пробирку, содержащую среду, раствор образует отдельный слой на дне. Теперь центрифугируйте пробирку на высокой скорости. Подушка сахарозы облегчает миграцию экзосом из среды в раствор сахарозы, сохраняя при этом целостность экзосом. Белковые загрязнители высокой плотности занимают границу раздела между раствором сахарозы и средой.

Осторожно перенесите основную фракцию слоя сахарозы, содержащей экзосомы, в свежую пробирку с подходящим буфером. Центрифуга на высокой скорости для получения гранулы очищенных экзосом. Выбросьте сахарозосодержащую надосадочную жидкость вместе с любыми белковыми загрязнителями. Суспендируйте гранулу экзосомы в буфере и храните при низких температурах до дальнейшего использования.

Чтобы предварительно очистить собранную кондиционированную среду, центрифугируйте ее при 500 х г в течение 5 минут при 4 градусах Цельсия. Переложите надосадочную жидкость в новую пробирку и выбросьте гранулу. После повторения этого этапа центрифугирования с восстановленной надосадочной жидкостью снова восстановите надосадочную жидкость и выбросьте гранулу.

Затем центрифугируйте восстановленную надосадочную жидкость при температуре 2000 x g в течение 15 минут и при температуре 4 градуса Цельсия. Оставьте надосадочную жидкость и выбросьте гранулы. Отфильтруйте надосадочную жидкость один раз через фильтр размером 0,22 микрометра, прикрепленный к 20-миллилитровому шприцу, в свежую центрифужную пробирку.

Между тем, чтобы приготовить 25% раствор сахарозы в оксиде дейтерия, аккуратно отвесить 1,9 грамма сахарозы в универсальной пробирке. Затем добавляйте оксид дейтерия, пока вес не достигнет 7,6 грамма. Затем наполните ультрацентрифужную пробирку 22,5 миллилитрами предварительно очищенной кондиционированной среды.

Поместите в пробирку стеклянную пипетку. Добавьте через пипетку 3 миллилитра раствора сахарозы так, чтобы раствор образовал отдельный слой под кондиционированной средой. Осторожно поместите пробирку, содержащую слоистый кондиционированный раствор сахарозы, в ведро поворотного ротора.

Закрепите ведро в роторе. Поместите ротор в ультрацентрифугу и вращайте его при температуре 100 000 x g при температуре 4 градуса Цельсия в течение 1,5 часов. Соберите 2 миллилитра слоя сахарозы из пробирки, по 1 миллилитру за раз, с помощью пипетки P1000 с наконечником, прикрепленным к наконечнику объемом 10 микролитров, и добавьте его во флакон ультрацентрифуги, содержащий 20 миллилитров отфильтрованного PBS для промывки.

Поместите пробирку в ротор с фиксированным углом наклона и центрифугируйте ее при давлении 100 000 x g при 4 градусах Цельсия в течение 1,5 часов. С помощью серологической пипетки объемом 10 миллилитров осторожно удалите надосадочную жидкость. Повторно суспендируйте гранулу с 400 микролитрами отфильтрованного PBS.