$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Чтобы выделить эпителиальные клетки почечных канальцев или ПЭС, начните с взятия только что выделенной почки мыши в чашке Петри. Отделите почечную капсулу - тонкий внешний слой, окружающий почку, - и удалите мозговое вещество или самую внутреннюю часть почки, оставив кору, содержащую канальцы и эпителиальные клетки канальцев.
Оставшиеся части почек измельчите на мелкие кусочки и инкубируйте их в теплом буфере для пищеварения, содержащем фермент коллагеназу. Коллагеназа расщепляет коллагеновый белок, который удерживает почечные ткани вместе, высвобождая почечные канальцы и почечные клетки в суспензию.
Процедите суспензию, чтобы удалить непереваренные ткани почек. Далее добавьте в фильтрат предварительно охлажденные питательные среды. Более низкая температура нейтрализует коллагеназу и останавливает дальнейшее переваривание тканей. Центрифугируйте фильтрат на низкой скорости, чтобы позволить более плотным канальцам и трубчатым клеткам оседать, в то время как другие типы клеток и примеси остаются во взвешенном состоянии.
Удалите эту нежелательную фракцию надосадочной жидкости и добавьте питательную среду для ресуспендирования гранулы. Поместите суспензию в чашку для культуры, покрытую коллагеном, и инкубируйте. Свободные трубчатые клетки прочно прикрепляются к коллагену, в то время как канальцы остаются подвешенными. Субкультура для удаления неприкрепленных канальцев и получения первичной культуры из клеток трубчатого эпителия.
Чтобы обработать собранные почки, сначала удалите почечные капсулы и мозговое вещество. Затем измельчите обе почки на крошечные кусочки и инкубируйте их в 10 миллилитрах буфера для пищеварения в духовке при температуре 37 градусов Цельсия при осторожном вращении в течение 5 минут.
После переваривания удалите все непереваренные ткани, пропустив буфер через фильтр 70 микрон. После сбора переваренной ткани добавьте 10 миллилитров питательной среды, чтобы остановить пищеварение. Затем центрифугируйте отфильтрованную тканевую суспензию при 50 х г в течение 5 минут для гранулирования трубчатых клеток. Затем перенесите надосадочную жидкость в новую пробирку, добавьте 5 миллилитров питательной среды и повторите центрифугирование, чтобы собрать все оставшиеся трубчатые клетки.
Теперь суспендируйте первую гранулу в 20 миллилитрах питательной среды и центрифугируйте ее при 50 х г в течение 5 минут для дальнейшей очистки собранных клеток. Утилизируйте надосадочную жидкость. Затем ресуспендируйте обе гранулы в 10 миллилитрах питательной среды. Далее подсчитайте живые клетки с помощью окрашивания Trypan Blue. Затем посадите до 10 миллионов клеток на 60-миллиметровую чашку, покрытую коллагеном, и дайте трубчатым клеткам прикрепиться на ночь.