Гидродинамическая инъекция почечной лоханки: метод прямой доставки ДНК в клетки почек мышиной модели

Чтобы доставить плазмидную ДНК непосредственно в клетки почек мыши, начните с помещения мыши, находящейся под наркозом, в боковое положение. Подготовьте мышь, удалив ее спинной мех сбоку. Найдите подходящее место разреза на левом боку, ниже грудной клетки.

Сделайте небольшой разрез в коже и нижележащих мышечных слоях. Затем слегка надавите на брюшную полость, чтобы обнажить почку через место разреза. Частично удалите покрывающую промежность жировую ткань для визуализации почечной лоханки.

Теперь возьмем шприц, содержащий плазмидную ДНК в гидродинамическом буфере доставки. Введите иглу непосредственно в почечную лоханку – треугольный, расширенный участок мочеточника в почке. Введите раствор плазмиды быстро так, чтобы ДНК напрямую достигла почечной паренхимы – функциональной части почки, которая фильтрует кровь.

Быстрая доставка большого объема жидкости через почечную лоханку создает высокое давление, создавая переходные поры в плазматической мембране клеток почечной паренхимы. Это облегчает поступление плазмид в клетки. В конце концов, эти поры закрываются, захватывая плазмиды внутри клеток.

Наконец, втяните иглу и верните почку в брюшную полость. Сшить кожу и мышечные слои в месте разреза.

Наденьте стерильные хирургические перчатки и, начиная со стороны разреза, трижды круговыми движениями промокните животное новым тампоном из хлоргексидина/спирта. Теперь найдите место разреза. Сожмите кожу пинцетом, и с помощью ножниц отрежьте слой кожи примерно на 1 сантиметр от позвоночника ниже грудной клетки. Сделайте еще один разрез по центру внизу в мышечном слое. Найдите почку и, не касаясь ее, аккуратно обнажите ее из брюшной полости, оказывая постоянное мягкое давление на живот пальцами.

Обнажить почку иногда бывает затруднительно. Слегка надавливайте на живот и позвоночник, чтобы не повредить селезенку. Если выходят другие органы, кроме почки, при необходимости аккуратно верните их в полость тела с помощью закрытых щипцов.

Затем аккуратно отделите почку от окружающего жира ровно настолько, чтобы визуализировать почечную лоханку, которую можно увидеть в виде маленькой белой точки. После визуализации почечной лоханки с помощью закрытых щипцов надавите на правую сторону почки, чтобы почечная лоханка оставалась в поле зрения. Затем возьмитесь за заряженный инсулиновый шприц в правой руке, держа его параллельно рабочей поверхности, и осторожно введите иглу в почечную лоханку.

После того, как игла будет введена, введите раствор быстро в течение 3 секунд. Оставьте иглу на месте примерно на 10 секунд, чтобы предотвратить обратный поток раствора. Затем медленно и осторожно извлеките иглу и верните орган в брюшную полость, аккуратно растягивая место разреза с помощью закрытых щипцов. Теперь сшите мышечный слой 5-0 рассасывающимися нитями и поместите от 2 до 4 независимых узлов. Аналогичным образом сшите слой кожи нерассасывающимися нейлоновыми нитями 5-0 или 6-0 и наложите от 2 до 4 независимых узлов.