Анализ экспрессии белков на основе массивов белков с обратной фазой: процедура одновременной количественной оценки экспрессии нескольких белков из клеточного лизата

Образец опухоли содержит гетерогенную популяцию белков. Используя лизат опухоли, несколько таких белков могут быть проанализированы параллельно, чтобы идентифицировать интересующий белок. Этот метод с высокой пропускной способностью называется Reverse Phase Protein Arrays или RPPA.

Для проведения РППА начинают с забора предметного стекла иммунологического анализа, покрытого нитроцеллюлозой. Обратите внимание на массив белков лизата опухоли на предметном стекле. Инкубируйте для захвата белка нитроцеллюлозой. Затем обработайте предметное стекло блокирующим буфером, который блокирует неспецифические сайты связывания антител на белках.

Удалите излишки блокирующего раствора. Теперь установите покрытое белком стекло в держатель и плотно закройте его. В результате на поверхности оползня образуются временные колодцы. Далее загрузите в лунки первичный раствор антитела. Эти антитела распознают эпитопы, присутствующие на соответствующей мишени, из смеси белков на матрице.

Наконец, добавьте флуоресцентно меченные вторичные антитела. Эти антитела присоединяются к предварительно связанным первичным антителам, образуя комплекс. Промойте предметное стекло, чтобы удалить все несвязанные вторичные антитела. Отстегните затвор от держателя и дайте ему высохнуть на воздухе.

Отсканируйте предметное стекло с помощью флуоресцентного сканера. Целевые белки, помеченные антителами, флуоресцируют на определенной длине волны и проявляются в виде цветных пятен на поверхности предметного стекла.

Перед печатью RPPA из каждого образца производится серия из пяти двойных разведений. Одним из самых трудоемких аспектов этой процедуры является изготовление сотен разведений. Успешный результат может быть гарантирован путем двойной проверки перед печатью слайдов.

Затем робототехнический споттер MicroGrid II используется для обнаружения лизатов белка на стеклянных предметных стеклах, покрытых нитроцеллюлозой. Каждый образец пятнится в трех экземплярах, в результате чего на образец получается в общей сложности 15 пятен. Слайды, использованные в этом эксперименте, содержат две прокладки, на которых наносятся образцы. На каждой площадке были обнаружены идентичные сэмплы, в данном случае 100 сэмплов. Другие доступные форматы включают слайды с 1, 8 и 16 блокнотами. Чем больше количество контактных площадок, тем меньшее количество образцов можно обнаружить на каждой из них.

Чтобы начать процедуру по обнаружению белка, влажные горки добавляют в избыток блокирующего буфера и выдерживают при комнатной температуре в течение 1 часа на качающейся платформе. Приготовьте 800 микролитров первичных антител в блокирующем буфере в нужных концентрациях и держите на льду. После часовой инкубации в блокирующем буфере установите предметные стекла либо в однокамерный зажим для стружки, либо в четырехсекционный держатель затвора FastFrame таким образом, чтобы между затвором и инкубационной камерой образовалось плотное уплотнение.

Удалите остаточный буфер из лунок и добавьте 600 микролитров первичного антитела в соответствующие лунки. Поместите горки и камеру в герметичную влажную коробку и инкубируйте на качающейся платформе в течение ночи при температуре 4 градуса Цельсия. На следующее утро уберите предметные стекла из холодильной камеры. Тщательно удалите первичные антитела из каждой лунки. Добавьте 600 микролитров 0,1% PBS-Tween20 или PBS-T и промойте горки на качающейся платформе при комнатной температуре в течение 5 минут.

Замените PBS-T на свежий PBS-T. Таким образом, промывайте горки в общей сложности три раза. Удалите буфер из лунок и добавьте 600 микролитров флуоресцентно меченных вторичных антител в соответствующем разведении в соответствующие лунки. Инкубировать со вторичными антителами при комнатной температуре в течение 45 минут с легким встряхиванием. Важно беречь мембрану от света до момента ее сканирования. Через 45 минут удалить вторичные антитела из лунок и кратковременно промыть трижды в 600 микролитрах PBS-T комнатной температуры.

Снимите слайды с переноски, переложите в подходящую емкость и промойте излишки PBS-T в течение 15 минут, сохраняя мембрану в темноте. Снимите PBS-T и промойте мембрану PBS при комнатной температуре в течение 15 минут, чтобы удалить остатки Tween20, снова держа мембрану в темноте. Сушите Fastslides в духовке при температуре 50 градусов Цельсия в течение 10 минут. Наконец, отсканируйте предметные стекла с точностью до 680 нм и/или 800 нм, в зависимости от используемых вторичных антител.