Внутривенное микровведение нефротоксинов эмбриону данио-рерио: метод доставки нефротоксических агентов в кровоток эмбриона данио-рерио
JoVE Encyclopedia of Experiments
Исследования рака
0 просмотров • 4:18 мин • April 30th, 2023
Внутривенная микроинъекция способствует доставке представляющих интерес молекул в кровоток животного-реципиента. Чтобы доставить нефротоксины в эмбрион рыбки данио, сначала приготовьте соответствующую концентрацию нужного раствора нефротоксина.
С помощью тонкого гелевого наконечника загрузите этот раствор нефротоксина в иглу для микроинъекций с заостренным угловым наконечником. Подвесьте иглу вертикально, чтобы раствор нефротоксина заполнил кончик иглы под действием силы тяжести. Теперь закрепите заряженную иглу для микроинъекций в держателе микроманипулятора.
Затем перенесите эмбрион данио-рерио, находящийся под наркозом, в готовую форму для микроинъекций. Выровняйте зародыш в форме так, чтобы его головка была ориентирована внутрь лунки, а хвост вышел из лунки, улучшив доступ к хвосту для микроинъекции. Далее точно расположите кончик иглы рядом с эмбрионом.
Введите раствор нефротоксина в хвостовую вену эмбриона. Введенные нефротоксичные агенты распространяются по кровотоку и достигают отдаленных органов, таких как почки. Аккуратно втяните иглу. Переложите эмбрион в свежую чашку, содержащую среду для эмбрионов, и дайте ему восстановиться. Инкубируйте эмбрион в течение определенного времени.
В течение нескольких часов после инъекции нефротоксины накапливаются в почках и вызывают повреждение, приводящее к снижению функции почек.
В день инъекции приготовьте нужный раствор нефротоксина с соответствующим контролем автомобиля. Сделайте вихрь или аккуратно перемешайте. После этого проверьте боковые стороны трубки и верхнюю часть водяного столба, чтобы убедиться, что лекарства растворены в растворе.
Загрузите обрезанную иглу для микроинъекций от 2 до 3 микролитров нефротоксина, продев тонкий гелевый наконечник в заднюю часть иглы, и подвесьте иглу вертикально с помощью куска ленты, чтобы раствор заполнил обрезанный кончик иглы под действием силы тяжести.
Как только кончик иглы заполнится, закрепите заряженную иглу в микроманипуляторе. Проверьте объем микровпрыска, поместив каплю минерального масла на предметное стекло микрометра, и введите в масло, чтобы оценить размер капли.
Далее достаньте чашку с эмбрионами из инкубатора и обезболите их, добавив в чашку для эмбрионов 5 миллилитров 0,2% Трикаина. Затем перенесите эмбрионы в форму для литья под давлением с помощью трансферной пипетки. Переместите каждый эмбрион в отдельную лунку формы, поместив голову в самую глубокую область лунки таким образом, чтобы хобот упирался в углубление, а хвост торчал из него.
Теперь вставьте заполненную иглу в микроманипулятор и расположите кончик иглы рядом с эмбрионом. Аккуратно введите иглу в хвостовую вену для микроинъекции.
Наиболее важным этапом процедуры является микроинъекция. Чтобы обеспечить успех, игла должна быть разрезана под острым углом и осторожно перемещена в положение рядом с эмбрионом.
Если инъекция прошла успешно, вы должны увидеть, как жидкость попадает в кровоток. Совместная инъекция нефротоксиканта с флуоресцентно конъюгированным декстрана позволит исследователю убедиться в успешности инъекции после процедуры. После этого аккуратно извлеките иглу из эмбриона.
Переложите эмбрион в чистую посуду и промойте, чтобы удалить трикаин свежим E3/PTU. Затем инкубируйте эмбрион до желаемого момента времени для оценки морфологии, которая может быть задокументирована с помощью фотографии в монтажной среде из метилцеллюлозы, или процесса для экспериментального анализа по желанию.
Обратите внимание, что восстановление эмбрионов следует оценивать каждые 12-24 часа после инъекции, чтобы определить процент людей с отеком, который обычно указывает на повреждение почек.
Обзор
В данной статье описывается метод введения нефротоксинов в эмбрионы zebrafish посредством внутривенной микроинъекции. Процедура включает приготовление раствора нефротоксина, его загрузку в иглу для микроинъекций и осторожное введение в хвостовую вену эмбриона.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Биология развития
- Токсикология
Теоретические сведения
- Внутривенная микроинъекция — это метод, используемый для введения веществ в кровоток.
- Эмбрионы zebrafish являются распространенной моделью для изучения процессов развития и токсикологических эффектов.
- Нефротоксины позволяют получить представление о функциях и повреждениях почек.
- Данный метод обеспечивает точный контроль над временем и дозировкой воздействия нефротоксина.
Цель исследования
- Разработать надежный метод введения нефротоксинов в эмбрионы zebrafish.
- Оценить влияние воздействия нефротоксинов на функцию почек.
- Предоставить исследователям возможность визуализировать эффекты действия нефротоксинов с помощью флуоресцентных маркеров.
Используемые методы
- Приготовление раствора нефротоксина и контрольного раствора (плацебо).
- Заполнение микроинъекционной иглы раствором.
- Позиционирование и введение иглы в хвостовую вену анестезированных эмбрионов.
- Наблюдение за эмбрионами на предмет признаков повреждения почек после инъекции.
Основные результаты
- Успешное введение нефротоксинов в кровоток эмбрионов zebrafish.
- Накопление нефротоксинов в почках, приводящее к заметным повреждениям.
- Подтверждение успешности инъекции с помощью флуоресцентно-конъюгированного декстрана.
- Оценка восстановления эмбрионов и функции почек с течением времени.
Выводы
- Метод микроинъекций эффективен для изучения нефротоксических эффектов у эмбрионов zebrafish.
- Мониторинг функции почек после инъекции предоставляет ценные данные о воздействии нефротоксинов.
- Данный метод может быть адаптирован для различных веществ с целью изучения их влияния на развитие.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Данная методика позволяет точно вводить нефротоксичные соединения в кровоток эмбриона данио-рерио, что способствует раннему механистическому снижению рисков по нефротоксичности при поиске лекарственных средств. Создание воспроизводимой модели острого повреждения почек помогает в валидации мишеней и повышает прогностическую достоверность оценки нефротоксического потенциала. Метод обеспечивает трансляционную преемственность от этапа поиска до доклинической оценки профилей безопасности соединений.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: Позволяет проверять терапевтические гипотезы, касающиеся механизмов повреждения почек, вызванного нефротоксинами.
- Практическая ценность: Обеспечивает стандартизированный подход к введению исследуемых соединений для оценки их влияния на функцию почек.
Скрининг и разработка методов анализа
- Научная ценность: Облегчает подготовку валидированных биологических систем для последующих рабочих процессов по скринингу нефротоксичности.
- Практическая ценность: Способствует стандартизации анализа за счет контролируемого внутривенного введения и количественной оценки показателей повреждения.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Соответствует системам, релевантным для заболевания, путем моделирования механизмов острого повреждения почек in vivo.
- Операционная ценность: Позволяет принимать обоснованные с учетом рисков решения о дальнейшем продвижении исследования на основе дозозависимых фенотипов повреждения почек.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод интегрируется в рабочие процессы раннего этапа поиска лекарственных средств, позволяя проверять гипотезы о механизмах нефротоксичности и поддерживать идентификацию ведущих соединений посредством функциональной оценки почечного риска.
- Фундаментальная биология: способствует снижению рисков при изучении механизмов, уточняя пути повреждения почек, вызванного нефротоксинами.
- Скрининг: повышает готовность анализа за счет воспроизводимого способа введения и измеряемых функциональных результатов, таких как образование отеков.
- Аналитика: обеспечивает количественное измерение зависимых переменных, таких как частота возникновения отеков и изменения морфологии почек.
- Трансляционные исследования: связывают результаты фундаментальных открытий с этапом доклинических исследований благодаря консервативности реакций на повреждение почек у позвоночных.
- Корпоративное использование: создает многократную платформу для оценки различных нефротоксических соединений в рамках нескольких проектов.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает достоверность прогнозирования при валидации мишеней за счет снижения механистической неоднозначности путей повреждения почек.
- Операционная ценность: Улучшает стандартизацию и воспроизводимость оценок нефротоксичности в различных исследованиях.
- Стратегическая ценность: Повышает качество принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) за счет получения ранних биологических сигналов о рисках.
- Влияние на портфель: Позволяет проводить приоритизацию с учетом рисков на основе количественных порогов повреждения почек.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с данио-рерио, владение методами микроинъекций и протоколами применения анестетиков.
- Необходимы системы микроманипуляторов, заточенные иглы и средства верификации флуоресценции.
- Требуется межгрупповая стандартизация стадирования эмбрионов, объема инъекций и мониторинга восстановления.
- Необходимо учитывать особенности адаптации в зависимости от растворимости и профилей стабильности различных нефротоксинов.
- Существуют практические ограничения, такие как вариабельность выживаемости эмбрионов и зависимость от технических навыков для обеспечения стабильного венозного доступа.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Оценка данио рерио функции почек с помощью флуоресцентного Зазор Пробирной
Похожие видео
0 Просмотры
Точный подход к клеточной абляции для моделирования острой почечной недостаточности при развитии рыбок данио
Похожие видео
0 Просмотры
Разработка Ларвал Зебрафиш Инфекция Модель Clostridioides difficile
Похожие видео
0 Просмотры
Микроинъекция мРНК и Олигонуклеотиды морфолино антисмысловых в данио рерио эмбрионов.
Похожие видео
0 Просмотры
Микроинъекции данио рерио Эмбрионы для анализа функции гена
Похожие видео
0 Просмотры
Ретро-орбитальный инъекций у взрослых данио рерио
Похожие видео
0 Просмотры
Внутривенно микроинъекции данио рерио Личинки по изучению Острое повреждение почек
Похожие видео
0 Просмотры
Лазерной абляции предпочки данио рерио по изучению почечных эпителиальных Регенерация
Похожие видео
0 Просмотры
Микроинъекция эмбриона: техника доставки соединения в желток данио-рерио
Похожие видео
0 Просмотры
Микроинъекция бактерий в хвостовую вену эмбрионов данио-религии
Похожие видео
0 Просмотры
Последнее обновление: 29 августа 2026