$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Патология расширения, или ExPath, — это метод подготовки образцов биологических образцов, который позволяет с помощью обычной световой микроскопии получать изображения наноразмерных структур путем их расширения с помощью полимерной системы.
Сначала возьмите обработанное иммуноокрашенное предметное стекло и покройте его анкерным раствором, содержащим как белковые, так и полимер-реактивные группы. Белок-реактивная группа якорного реагента связывается с аминами биомолекул внутри клеток.
Затем добавьте подходящий желирующий раствор на образец и инкубируйте, чтобы обеспечить его диффузию внутри тканей. Полимерно-реакционноспособная группа закрепляющего реагента связывается со свободными мономерами в растворе желирования, позволяя биомолекулам прикрепляться к полимеру по мере его полимеризации.
Как только полимеризация образца будет завершена, накройте предметное стекло раствором протеиназы. Протеиназы переваривают цитоскелетные белки, чтобы устранить любую структурную резистентность, позволяя клеткам расширяться без разрыва. После ферментативного разложения желированный образец отделяется от предметного стекла и переходит в суспензию.
Теперь перенесите образец в подходящий буфер для промывки в контейнере, совместимом с микроскопом. Далее замените буфер водой и инкубируйте. Полимер поглощает огромное количество воды относительно своей массы и разбухает.
По мере расширения полимера биомолекулы, прикрепленные к полимерной сети, расходятся, сохраняя при этом свою пространственную ориентацию. Это позволяет легко визуализировать их под обычным световым микроскопом.
Приготовьте анкерный раствор в соответствии с инструкциями на рукописи. Поместите горки в 100-миллиметровую чашку Петри. Нанесите якорный раствор на ткани пипеткой и инкубируйте их не менее 3 часов при комнатной температуре. Затем приготовьте желирующий раствор в соответствии с указаниями рукописи.
Удалите излишки анкерного раствора с участка ткани и поместите предметное стекло обратно в чашку Петри. Добавьте к образцу свежий холодный желирующий раствор и инкубируйте смесь в течение 30 минут при температуре 4 градуса Цельсия. Чтобы соорудить камеру на предметном стекле вокруг образца, создайте распорки, тонко разрезая кусочки покровного стекла алмазным ножом. Закрепите спейсеры по обе стороны ткани водой и осторожно накройте предметное стекло крышкой, стараясь не задерживать пузырьки воздуха над тканью.
Затем инкубируйте образец при температуре 37 градусов Цельсия во влажной среде в течение 2 часов. Снимите крышку камеры желирования, осторожно проведя лезвием бритвы под покровным стеклом и медленно приподняв его с поверхности геля. Обрежьте пустой гель вокруг ткани, чтобы свести к минимуму объем, обязательно разрезая гель ассиметрично, чтобы отслеживать ориентацию.
Разведите протеиназу K 1:200 в буфере для разложения, убедившись, что раствор достаточен для полного погружения геля. Затем инкубируйте образец с раствором в закрытой емкости в течение 3 часов при температуре 60 градусов Цельсия. Если образец не отделяется во время разложения, аккуратно удалите его бритвенным лезвием.
Используйте мягкую кисть, чтобы перенести образец в 1X PBS в контейнер, совместимый с желаемой системой визуализации и достаточно большой, чтобы вместить полностью растопыренный гель. Промойте образец в PBS в течение 10 минут, и при желании повторите его с помощью 300-миллимолярного DAPI. Разверните образцы, промыв образец избыточным объемом дважды дистиллированной воды от 3 до 5 раз в течение 10 минут за одну промывку. Затем выполните флуоресцентную визуализацию.