Аспирация жидкости из клубочков мыши: метод аспирации клубочковой жидкости из мыши с помощью двухфотонной микропунктуры

В почках клубочек — пучок мелких кровеносных сосудов, заключенный в капсулу Боумена — инициирует фильтрацию крови и выводит отработанную жидкость в окружающее пространство Боумена. Исследование содержимого клубочковой жидкости помогает понять физиологию почек.

Чтобы аспирировать клубочковую жидкость, подготовьте мышь, находящуюся под наркозом, и ее почка будет выведена хирургическим путем. Теперь введите флуоресцентный краситель в кровеносные сосуды за глазной орбитой мыши. Молекулы флуоресцентного декстрана перемещаются по кровотоку и достигают почек.

Благодаря высокой молекулярной массе декстрана флуоресцентный краситель задерживается в клубочке, придавая ему зеленый цвет. Под двухфотонным микроскопом, который позволяет визуализировать глубоко расположенные структуры, найдите подходящий клубочек, чтобы получить адекватный доступ к клубочковой жидкости.

Затем совместите наконечник микропипетки с красным флуоресцентным покрытием из наночастиц с боковой осью почки. С помощью микроманипулятора продвиньте наконечник пипетки, чтобы проникнуть в почку. Когда наконечник достигнет целевого клубочка, установите желаемую скорость аспирации для аспирации клубочковой жидкости из пространства Боумена.

Отсутствие зеленой флуоресценции внутри красного кончика пипетки указывает на отсутствие кровотечения и подтверждает успешную аспирацию клубочковой жидкости. Затем втяните пипетку и храните жидкость в подходящем буфере для дальнейшего анализа.

После подтверждения отсутствия реакции на защемление пальцев ног нанесите мазь на глаза и с помощью пластыря обездвижите конечности взрослой мыши весом от 20 до 25 граммов. Используйте крем для депиляции, чтобы удалить всю шерсть с левой стороны животного, и используйте селезенку, чтобы найти левую почку через кожу на дорсальной и каудальной стороне селезенки.

Сделайте разрез на коже толщиной 0,5 сантиметра, а затем меньший разрез в брюшине, достаточно большой, чтобы через него можно было протолкнуть почку. Выдавите почку с легким давлением и поместите полисилоксановый стабилизатор почек вокруг ткани. Выровняйте почку с помощью спейсера таким образом, чтобы крайняя боковая поверхность почки выходила за пределы стабилизатора примерно на 1 миллиметр, и зафиксируйте почку в форме с помощью цианоакрилатного клея. Приклейте пластину головки к форме стабилизатора и закрепите пластину головки к монтажным планкам на опорной плите.

Далее заполните лунку в полисилоксановой подложке 1% раствором агарозы и удерживайте сверху формы 10-миллиметровый покровный стекло до тех пор, пока агароза не станет твердой. Приклейте покровное стекло к пластине головки с помощью клея и создайте кольцо вокруг покровного стекла с помощью стоматологического цемента. Затем введите от 100 до 150 микролитров FITC-декстрана ретроорбитально и быстро переместите мышь и фиксирующую пластину на предметный столик двухфотонного микроскопа.

После ручной фокусировки на поверхности почки переключитесь в несканирующий двухфотонный режим и исследуйте окно визуализации, чтобы найти целевой клубочек, который находится более чем на 30 микрометров ниже покровного стекла и менее чем в 400 микрометрах от боковой капсулы почки. Запишите боковое и вертикальное расстояние до целевого клубочка. Затем запишите координаты стадий x, y и z для клубочка и, наконец, поднимите фокусную точку цели примерно на 1 миллиметр в толщу воды, не изменяя координаты стадии x и y.

Введите наконечник пипетки в толщу воды и включите возбуждение DAPI. Переместите пипетку в размерах X и Y до точки максимальной флуоресценции наконечника. Это будет центром цели. Измените настройку возбуждения на красный флуоресцентный белок и визуализируйте пипетку с помощью окуляра, чтобы обеспечить точное центрирование в глазном обзоре.

Переключитесь обратно на двухфотонный режим, чтобы найти пипетку под двухфотонным изображением в реальном времени, и поместите наконечник точно в центр изображения. Это позиция регистрации. Затем сохраните изображение пипетки и зарегистрируйте координаты предметного столика и контроллера микропипетки. Извлеките пипетку из толщи воды по оси x, не перемещая оси y и z, и переместите пипетку Z к координате целевого клубочка Z и краю почки.

Обратите внимание на стадию X и рассчитайте край почки пипетки X, используя смещение от регистрационного этапа X. Увеличьте ступень X, чтобы переместить предметный столик к пипетке до тех пор, пока край почки не окажется далеко слева от экрана, оставаясь видимым. Быстро переместите пипетку примерно на 100 микрометров от края почки Х пипетки, как только что было рассчитано. Увеличьте усиление красного цвета и начните медленно продвигаться кончиком пипетки к краю почки под помощью двухфотонной визуализации в реальном времени, контролируя гистограмму красного пикселя.

Медленно проведите пипетку по оси X к целевому пипетке X-клубочка, не сводя глаз с предметного столика X. Достигнув клубочка, задокументируйте положение с помощью стека Z. Установив пипетку на место, настройте микронасос на впрыскивание 100 нанолитров перфтордекалина в течение 2 минут, чтобы обеспечить проходимость пипетки и уменьшить путаницу из-за закупорки пипетки во время входа. После 4-6 минут фильтрации установите микронасос на аспирацию до 300 нанолитров со скоростью до 50 нанолитров в минуту.