Изучение, зависящими от возраста геномной нестабильности использованием С. CEREVISIAE Хронологические Модель продолжительность жизни

Общая цель этой процедуры заключается в изучении возрастной геномной нестабильности у дрожжей путем объединения хронологической продолжительности жизни с набором простых анализов повреждений ДНК и мутаций. Это достигается путем первого отбора проб культур хронологического старения каждые два дня и проверки жизнеспособности по колониеобразующей единице или образованию КОЕ. Следующим этапом процедуры является изучение мутаций ДНК путем отбора образцов стареющих культур и нанесения клеток на среду отбора, специфичную для мутаций.

В конечном счете, могут быть получены результаты, которые показывают изменения в мутациях ДНК во время хронологического старения дрожжей путем нормализации результатов анализа мутаций до жизнеспособности. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области старения, такие как механизмы, связывающие старение и геномную нестабильность в aria. Чтобы определить хронологическую продолжительность жизни дрожжей или CLS, сначала инокулируйте одну дрожжевую колонию в один миллилитр синтетической полной глюкозы или среды SDC и инкубируйте в течение ночи с встряхиванием при 30 градусах Цельсия на следующий день. Разведите ночную культуру в 10 миллилитрах свежей среды SDC до наружного диаметра 600 от 0,05 до 0,1, инкубируйте с встряхиванием при 30 градусах Цельсия в течение трех дней.

На третий день, когда клетки находятся в неподвижной фазе, разведите каждую Eloqua в 10 000 раз в автоклавной воде, затем извлеките две аликвоты по 10 микролитров из колбы и нанесите по 10 микролитров каждой разведенной культуры на планшет A-Y-E-P-D. Инкубируйте пластину при температуре 30 градусов Цельсия до тех пор, пока не возникнут колонии. Количество колоний, возникших или образующих колонии единиц с третьего дня культуры, считается 100% выживанием.

Продолжайте удалять аликвоты из культуры старения в последующие дни для покрытия. Соответствующая корректировка коэффициентов разведения для обеспечения примерно от 20 до 100 колоний в анализе КОЕ. Отбор проб прекращают, когда жизнеспособность культуры снижается ниже 1%, обычно между 11 и 13 днями, жизнеспособность клеток также может быть изучена в клетках, состаренных на планшетах.

Чтобы начать этот анализ, инокулируйте одну колонию в один миллилитр синтетической полной глюкозной среды и инкубируйте в течение ночи при встряхивании при 30 градусах Цельсия. Когда культура вырастет примерно до 10-восьмой клеток на миллилитр, разбавьте культуру водой автоклава до 100-200 клеток на 10 микролитров и 1000 клеток на 10 микролитров. Для каждого штамма приготовьте набор из восьми-20 пластин SDC с выпадением тритофана, помеченных в соответствии с плотностью покрытия.

Чтобы обеспечить от 10 до 100 колоний, можно насчитать в ожидании снижения жизнеспособности во время старения тарелку по две аликвоты от 10 до 30 микролитров разведенной культуры на каждую пластину. Инкубируйте планшет, установленный при температуре 30 градусов Цельсия, в течение всего срока анализа продолжительности жизни в день нанесения покрытия, а затем каждые два дня извлекайте одну пластину и по каплям добавляйте 0,5 миллилитра тритопана, чтобы позволить жизнеспособным клеткам расти. Инкубируйте пластину при температуре 30 градусов Цельсия еще от 48 до 72 часов.

Через 48 - 72 часа. Подсчитайте КОЕ на предмет жизнеспособности на день выпуска триптофана, чтобы проанализировать четыре повреждения ДНК и частоту мутаций в течение хронологического старения. Ряд странных с особыми особенностями выращивают параллельно со штаммом дикого типа для дрожжевого CLS-анализа.

Частоту спонтанных мутаций можно оценить путем измерения частоты резистентности к ванированию канны в хронологически стареющей культуре. Мутации в гене, который кодирует пермеазу аргинина в плазме, делают клетки устойчивыми к аналогу аргинина L Canavan Устойчивые клетки будут расти на выпадении аргинина Синтетические полные средние пластины, дополненные сульфатом L. Канаван, измерение частоты положительной реверсии трипа у штамма, содержащего янтарную мутацию в трипе. Одна последовательность нанесения покрытия позволяет оценить скорость замещения оснований во время хронологического старения дрожжей.

Клетки положительной реверсии будут расти на пластинах с выпадением триптофана. Лизоотрицательный штамм EH one 50 содержит сдвиг плюс четыре в открытой рамке считывания, что приводит к атрофии лизина у быка, и это может быть обращено вспять с помощью небольших мутаций вставки или делеции. Ревертанты будут выбраны на пластинах с дропаутом лизина для обнаружения грубых хромосомных перестроек или gcr.

Используется мутантный штамм, в котором HX T 13, расположенный на 7,5 килооснованиях теломерно к одному на пятой хромосоме, нарушен мутациями U трех кассет в обоих генах может один и три гена, что делает клетки устойчивыми к L, канавану и пяти фтороротовой кислоте соответственно. Поскольку частота точечных мутаций, происходящих в обоих генах, является низкой, анализ частоты резистентности как к Эль Канавану, так и к пяти фтороротиновой кислоте позволяет оценить gcr для мониторинга уровня гомологичной и гомологичной рекомбинации. В течение хронологического старения генерируются мутанты, которые несут либо 100% гомологичных инвертированных повторов, либо 91% гомологичных.

IRS в его трех локусах рекомбинация между IRS позволяет экспрессировать функциональные его три белка. Таким образом, клетки, в которых произошла рекомбинация, будут расти на пластинах с выпадением гистидина с добавлением галактозы. На третий день, когда клетки находятся в стационарной фазе и соответствующее количество клеток будет удалено из каждой стареющей культуры.

Поскольку для всех анализов используется одна и та же процедура, будет обработан только один образец. Для целей этого видео гранулируйте клетки путем вращения в настольной центрифуге. Удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клетки в одном миллилитре водяной гранулы автоклава.

Снова удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в 100 микролитрах водяной пластины клеток на соответствующих пластинах для выбора желаемых возвратов. Инкубируют планшеты при 30 градусах Цельсия через три-четыре дня подсчитывают КОЕ, частоту мутаций нормализуют до количества жизнеспособных клеток. На этом графике представлены репрезентативные результаты типичного хронологического анализа продолжительности жизни, когда хронологическая выживаемость клеток дикого типа сравнивается с S CH, девятью дельта-TOR, одним дельта-мутантами и RA двумя дельта-мутантами.

В жидких культурах мутанты, лишенные TOR 1, CH 9 или RAs 2, демонстрируют увеличенную хронологическую продолжительность жизни. Кроме того, дефицит s CH 9 и RA 2 оказывает аддитивное влияние на содействие долголетию и хронологическое выживание в присутствии различных источников углерода. Использование анализа жизнеспособности NC two показано на следующем графике.

В первый день культуры дикого типа SDC были разбавлены и нанесены на пластины для выпадения SC без источника углерода. Планшеты SC Tripp с добавлением глюкозы, этанола или глицериновых оратов инкубировали при температуре 30 градусов Цельсия каждые два дня. Из каждого набора извлекали по одной тарелке и добавляли соответствующие питательные вещества, чтобы обеспечить рост и образование колоний.

Частота мутаций, зависящая от возраста, сильно варьируется в зависимости от штамма, фона, генетических манипуляций, культуры, условий и возраста. В этой таблице приведены типичные результаты, полученные при штамме дикого типа. Репрезентативные результаты синтеза транс-поражения показаны на следующем изображении.

Возрастное увеличение частоты мутаций может быть связано с изменениями в ошибочной репарации ДНК с использованием ядерных экстрактов и различных матриц ДНК. Мы можем оценить синтез трансляции или TLS в хронологически возрастных клетках. Были проанализированы ядерные экстракты из трехдневной стационарной фазы, дикого типа и девяти дельта-мутантных клеток SCH.

Продукты TLS с неповрежденным шаблоном обозначены сплошными линиями, а продукты TLS с поврежденным шаблоном обозначены пунктирными линиями. Синтез транс-повреждений в ядерных экстрактах из долгоживущих свободных праймеров с CH девятью дельта-мутантами отсутствовал, что обозначено открытой стрелкой. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как проводить хронологический анализ продолжительности жизни и мутаций ДНК у дрожжей.