Универсальное редактирование генома CRISPR: метод направленного восстановления генов на основе гомологии в культивируемых клетках с использованием системы CRISPR-Cas9

Начните с добавления CRISPR-плазмиды «все в одном» к иммунным клеткам, присутствующим в пробирке. Эта плазмида содержит ген Cas9 в комбинации с sgRNA или однонаправляющей РНК, кодирующей последовательность, комплементарную последовательности-мишени в геноме хозяина.

Добавьте линеаризованную донорскую плазмиду, содержащую трансген, зажатый между гомологическими плечами или ГА - повторы ДНК необходимы для гомологичной рекомбинации. Проводят электропорацию, при которой с помощью электрического тока плазмидная смесь вводится в клетку. Попадая внутрь, обработанная sgРНК образует комплекс с экспрессируемой нуклеазой Cas9.

sgRNA связывается с сайтом-мишенью, позволяя нуклеазе Cas9 идентифицировать специфическую узнавающую последовательность, известную как протоспейсерный соседний мотив или PAM, и расщеплять ДНК хозяина рядом с ней. Это создает двухцепочечный разрыв с тупым концом, где клеточный механизм резецирует ДНК, создавая 3'-выступы. Наличие фланкирующих сайтов HA запускает механизм репарации, направленный на гомологию, когда разрезанная ДНК присоединяется к последовательности HA, образуя гетеродуплексную структуру - D-петлю.

Синтез ДНК продолжается, формируя цепь, комплементарную последовательности трансгена, до тех пор, пока она не воссоединится с исходной цепью ДНК. Верхняя часть D-петли действует как шаблон для синтеза недостающей части ДНК, генерируя двойные соединения Холлидея — структуры, в которых взаимодействуют четыре нити ДНК. Эти соединения разрешаются, и пробелы восстанавливаются, облегчая вставку гена-мишени.

Приготовьте 24-луночный планшет, содержащий 500 микролитров полной питательной среды без антибиотиков в каждой лунке. Предварительно прогрейте тарелку во влажном до 37 градусов 5% углекислом газе инкубаторе. Включите систему электропорации. Входные параметры электропорации для ячеек JURKAT или RAW.

Приготовьте смесь клетки и ДНК для электропорации. Соберите культуру клеток ЮРКАТ в колбу площадью 25 квадратных сантиметров. Перенесите ячейки в центрифужную пробирку объемом 50 мл. Затем гранулируйте клетки центрифугированием при плотности 90 x g в течение восьми минут при комнатной температуре.

Что касается надосадочной жидкости, то для промывания суспендируйте клетки с 5-мл DPBS. Затем раскрутите клеточную суспензию центрифугированием, используя те же условия, что и на предыдущем этапе. Извлеките DPBS и повторно суспендируйте клеточную гранулу, используя 2 мл DPBS. Используйте 10 микролитров клеточной суспензии и смешайте с равным объемом 0,2% трипанового синего.

Чтобы оценить количество ячеек, загрузите образец на этот счетный слайд. Вставьте слайд подсчета в автоматический счетчик ячеек и просмотрите изображение ячеек, а затем получите результат подсчета ячеек. Рассчитайте 2 миллиона клеток для 5 повторений электропорации в одном эксперименте.

Перенесите необходимое количество ячеек в центрифужную пробирку объемом 1,5 мл. Пеллетные ячейки методом центрифугирования. Чтобы сэкономить время, электропорационную смесь можно приготовить на этапе центрифугирования. Добавьте по 2,5 мкг каждого вектора CRISPR-Cas9, по 2,4 мкг линеаризованного вектора нацеливания и повторно суспензируйте Buffer R до общего объема 55 мкл в новой центрифужной пробирке объемом 1,5 мл.

Слегка закрутите вихрем и кратковременно вращайте, чтобы хорошо перемешать. Перед использованием оставьте смесь для электропорации при комнатной температуре. После вращения аспирируйте DPBS, затем центрифугируйте еще 30 секунд. Удалите как можно больше надосадочной жидкости. Повторно суспензируйте ячейки, добавив приготовленную смесь для электропорации. Аккуратно проводите пипеткой вверх и вниз.

Электропорация: Что касается смеси для электропорации клеток, используйте наконечник для нуклеофекции объемом 10 микролитров с пипеткой.

Важно: Не допускайте образования пузырьков воздуха во время пипетирования, это приведет к сбою электропорации. Нажмите «Старт».

После электропорации переведите образец в одну лунку из 24-луночных планшетов с предварительно подогретой питательной средой. Проведите те же процедуры электропорации, что и выше, на оставшихся 4 образцах повторите. Осторожно покачивайте пластину, чтобы обеспечить равномерное распределение ячеек. Инкубируйте клетки в инкубаторе с температурой 37 градусов в течение 48–72 часов до сортировки клеток по методу FACS.