Универсальное редактирование генома CRISPR: метод направленного восстановления генов на основе гомологии в культивируемых клетках с использованием системы CRISPR-Cas9

Начните с добавления CRISPR-плазмиды «все в одном» к иммунным клеткам, присутствующим в пробирке. Эта плазмида содержит ген Cas9 в комбинации с sgRNA или однонаправляющей РНК, кодирующей последовательность, комплементарную последовательности-мишени в геноме хозяина.

Добавьте линеаризованную донорскую плазмиду, содержащую трансген, зажатый между гомологическими плечами или ГА - повторы ДНК необходимы для гомологичной рекомбинации. Проводят электропорацию, при которой с помощью электрического тока плазмидная смесь вводится в клетку. Попадая внутрь, обработанная sgРНК образует комплекс с экспрессируемой нуклеазой Cas9.

sgRNA связывается с сайтом-мишенью, позволяя нуклеазе Cas9 идентифицировать специфическую узнавающую последовательность, известную как протоспейсерный соседний мотив или PAM, и расщеплять ДНК хозяина рядом с ней. Это создает двухцепочечный разрыв с тупым концом, где клеточный механизм резецирует ДНК, создавая 3'-выступы. Наличие фланкирующих сайтов HA запускает механизм репарации, направленный на гомологию, когда разрезанная ДНК присоединяется к последовательности HA, образуя гетеродуплексную структуру - D-петлю.

Синтез ДНК продолжается, формируя цепь, комплементарную п