phiC31-интегразо-опосредованная сайт-направленная трансгенная интеграция: техника микроинъекций для сайт-специфической трансгенной интеграции в вектор Anopheles

Интегразаза phiC31 представляет собой фермент рекомбиназы, полученный из фагов и катализирующий сайт-специфическую рекомбинацию трансгена, чужеродного гена, в геном хозяина. Для интеграции трансгена в организме хозяина Anopheles начните с эмбриона Anopheles в подходящем буфере.

Геном Anopheles предварительно сконструирован с сайтом прикрепления для интеграции генов и голубым флуоресцентным маркером для визуального отбора. Затем добавьте во флакон небольшой объем донорской плазмиды, несущей желаемый трансгенный груз, место прикрепления, красный флуоресцентный маркер и компоненты плазмидного каркаса. Затем добавьте оптимальный объем вспомогательной плазмиды, несущей ген-кодирующую интегразу. Теперь загрузите плазмидную смесь в микрошприц.

Осторожно введите плазмиды в задний полюс эмбриона, место происхождения половых клеток, что приведет к небольшому движению цитоплазмы. Оказавшись внутри эмбриона, плазмида-помощник начинает синтезировать ферменты интегразы.

Фермент интегразы опосредует сайт-специфическую рекомбинацию между донорской плазмидой и геномом хозяина. Таким образом, трансген и красный флуоресцентный маркер из донорской плазмиды интегрируются в рекомбинантные сайты прикрепления в геноме Anopheles. После этого инкубируйте введенный эмбрион в физиологических условиях для вылупления, с прерывистым завихрением.

В течение нескольких дней из эмбриона вылупляется личинка. Под флуоресцентным микроскопом личинка Anopheles с успешно интегрированными генами экспрессирует как голубую флуоресценцию, маркирующую геном хозяина, так и красную флуоресценцию, маркирующую трансген из донорской плазмиды.

Очистите донорские и хелперные плазмиды с помощью набора для очистки, не содержащего эндотоксинов. Объедините меченную attB донорскую плазмиду, несущую представляющий интерес трансген, и хелперную плазмиду, несущую интегразу, чтобы получить смесь с конечной концентрацией 350 нанограмм на микролитр донорской плазмиды и 150 нанограмм на микролитр хелперной плазмиды.

Осаждение ДНК путем добавления 0,1 объема 3 моляра ацетата натрия, в 2,5 объема ледяного 100% этанола. Затем, вихрь. Сразу должен быть виден белый осадок. Промойте гранулу и повторно суспендируйте ее в инъекционном буфере, чтобы достичь общей конечной концентрации 500 нанограмм на микролитр. Затем приготовьте аликвоты объемом от 10 до 15 микролитров каждая и храните их при температуре минус 20 градусов по Цельсию.

Скармливайте кровью комаров в возрасте от 4 до 7 дней из нужной стыковочной линии, а также их собратьев дикого типа за 72 часа до микроинъекции. Выполните микроинъекции эмбриона Anopheles gambiae в 25 миллимолярных хлоридах натрия, нацеливаясь на задний полюс эмбриона под углом 45 градусов.

Выполняйте микроинъекции эмбриона Anopheles stephensi в галогеноуглеродном масле, нацеливаясь на задний полюс под углом 30 градусов. Сразу после инъекции переложите яйца в чашку Петри, наполненную стерильной дистиллированной водой, и верните их в инсектарные условия. После вылупления ежедневно перекладывайте личинок G₀ в лоток с подсоленной дистиллированной водой и выращивайте куколок.