Инактивация генов-мишеней на основе системы CreER-LoxP: индуцируемая тамоксифеном система рекомбиназы Cre для нокаута гена-мишени в мышиной модели

Начнем с генетически модифицированной модели мыши, содержащей модифицированный геном, который содержит сайты LoxP — специфические последовательности, распознаваемые ферментами Cre-рекомбиназы — фланкирующими интересующий ген. В дальнейшем мышь трансфицируют плазмидным вектором, кодирующим органоспецифическую CreER-рекомбиназу, что приводит к интеграции элемента, экспрессирующего CreER-рекомбиназу, в геном клеток печени.

Экспрессированная CreER рекомбиназа, неактивный гибридный белок, включающий Cre рекомбиназу и мутантный лиганд-связывающий домен рецептора эстрогена, ER, взаимодействует и связывается с белком теплового шока в цитоплазме. Это связывание ограничивает CreER рекомбиназу в цитоплазме.

Приготовьте раствор тамоксифена, гидрофобного препарата, используя этанол и подходящее масло. Теперь введите раствор тамоксифена внутрибрюшинно в левый нижний квадрант брюшной полости мыши, чтобы предотвратить повреждение органов брюшной полости.

Введенный тамоксифен метаболизируется в печени до 4-гидрокситамоксифена, 4-ОХТ. Кроме того, 4-OHT, селективный модулятор рецептора эстрогена, связывается с ER-лиганд-связывающим доменом CreER-рекомбиназы, вызывая ее конформационное изменение. Это