Энциклопедия экспериментов JoVE
Биологические методы
0 просмотров • 3:27 мин. • July 8th, 2025
Система Tetracycline-On или Tet-On представляет собой условную систему экспрессии генов, которая активирует экспрессию интересующего гена в присутствии тетрациклина или его аналога доксициклина.
Начнем с генетически модифицированной мыши с модифицированным геномом, содержащим ген, кодирующий обратный тетрациклин-контролируемый белок-активатор транскрипции, или rtTA, управляемый специфичным для печени промотором в клетках печени или гепатоцитах. Кроме того, мышь содержит ген, представляющий интерес под контролем тетрациклинового оператора или последовательности tetO, расположенные выше по потоку и селективно слитые с минимальным промотором. TetO и промотор называются тетрациклин-чувствительным элементом, или TRE.
Экспрессированный rtTA - гибридный белок, содержащий репрессор tet, tetR и домен трансактивации вирусного белка VP16 - образует димеры, которые неактивны и не могут связываться с последовательностью tetO TRE, препятствуя активации экспрессии гена-мишени.
Приготовьте раствор, содержащий доксициклин и сахарозу. Добавление сахарозы повышает вкусовые качества. После фильтрации предоставьте мышке раствор доксициклина и сахарозы в качестве питьевой воды. Введенный доксициклин накапливается в печени.
В гепатоцитах доксициклин связывается с rtTA, вызывая конформационные изменения и повышенное сродство к сайту связывания ДНК tetO. ДНК-связывающий домен tetR доксициклин-связанного rtTA связывается с последовательностью tetO элемента TRE. Домен VP16 далее рекрутирует РНК-полимеразу, что приводит к транскрипции, образованию мРНК и последующей экспрессии нижестоящего репортерного гена-мишени.
Для экспериментов продолжительностью менее 10 дней непрерывно вводите доксициклин через питьевую воду, используя следующий протокол. Сначала растворите 5 грамм сахарозы в 100 миллилитрах водопроводной воды, и проведите автоклав.
Затем растворите 100 миллиграммов доксициклина-гиклата в 5 миллилитрах раствора сахарозы в 15-миллилитровой конической пробирке. Затем с помощью 10-миллилитрового шприца стерильно отфильтруйте раствор через фильтр 0,2 микрона, затем добавьте отфильтрованный раствор доксициклина к оставшимся 95 миллилитрам раствора сахарозы и подайте раствор мыши вместо питьевой воды. Проверяйте ежедневно и немедленно заменяйте, если раствор становится мутным, так как это указывает на чрезмерный бактериальный рост.