Сайленсинг генов in vitro на основе обратной трансфекции миРНК: процедура доставки малых интерферирующих РНК в культивируемые клетки для инактивации экспрессии генов-мишеней

Для обратной трансфекции малых интерферирующих РНК, или миРНК, класса двухцепочечных РНК, в неадгезивные адипоциты или жировые клетки, готовят суспензию миРНК, нацеленную на специфический ген, кодирующий белки в адипоцитах. Добавьте подходящий реагент для трансфекции на основе катионных липидов. Инкубируйте смесь для образования трансфекционных комплексов путем электростатических взаимодействий.

Переложите смесь в покрытые коллагеном лунки многолуночной пластины. Трансфекционные комплексы иммобилизуются на покрытии пластины за счет неспецифических взаимодействий. Пипеткой введите суспензию адипоцитов в лунки, содержащие иммобилизованные трансфекционные комплексы. Адипоциты неплотно прилипают к покрытию пластины, увеличивая физический контакт между клетками и комплексами.

Трансфекционный комплекс сливается с клеточной мембраной и доставляет миРНК в цитоплазму. МиРНК, содержащая антисмысловую цепь с комплементарной последовательностью для целевой мРНК и сенсорную цепь, распознается мультибелковым РНК-индуцирующим сайленсингирующим комплексом, или RISC. МиРНК связывается с RISC, и нити отделяются, при этом антисмысловая цепь остается связанной с комплексом.

Активированный комплекс миРНК-RISC распознает и связывается с комплементарными сайтами на целевой мРНК. Это приводит к секвенс-специфическому расщеплению мРНК белком аргонавта комплекса RISC. Расщепленная мРНК еще больше разрушается клеточным механизмом, тем самым подавляя экспрессию генов-мишеней.

Пипетку из миРНК с улучшенной минимальной необходимой средой для смешивания и инкубируйте в течение 5 минут при комнатной температуре. Добавьте реагент для трансфекции и улучшенную минимальную эфирную среду к миРНК и перемешайте пипетку. Выдержите его в течение 20 минут при комнатной температуре. Затем добавьте смесь для трансфекции в каждую лунку пластины, покрытой коллагеном.

Вымойте клетки в 100-миллиметровой чашке Петри дважды с помощью DPBS. Добавьте в клетки 5-кратный трипсин, убедившись, что трипсином покрыта вся поверхность. Подождите 30 секунд, и осторожно удалите трипсин. Инкубируйте чашку Петри от 5 до 10 минут при температуре 37 °C в инкубаторе.

Затем постучите по чашке, чтобы отделить клетки, не повреждая их. Добавьте 10 миллилитров DMEM без пирувата, 25 мМ глюкозы, 10% FCS и по 1% пенициллина и стрептомицина, чтобы нейтрализовать трипсин. Осторожно пипетируйте среду вверх и вниз, чтобы отделить клетки и гомогенизировать клеточную суспензию.

Подсчитайте клетки с помощью счетной камеры Malassez или автоматического счетчика клеток и отрегулируйте концентрацию клеток до 6,25 x 10⁵ клеток/мл среды. Затравите 800 микролитров клеточной суспензии на лунку 12-луночного планшета или 400 микролитров клеточной суспензии на лунку 24-луночного планшета, содержащего трансфекционную смесь.

Инкубируйте планшеты в инкубаторе для клеточных культур, и не тревожьте их в течение 24 часов. На следующий день осторожно замените надосадочную жидкость свежим ДМЭМ без пирувата, 25 мМ глюкозы, 10% FCS и 1% пенициллина и стрептомицина, и верните клетки в инкубатор.