Индуцируемая регулируемая система Tet-Off: метод in vitro для модуляции экспрессии генов в культивируемых клетках с использованием системы Tetracycline-Off

Начните с приема суспензии культивируемых клеток реципиента в пробирке. Дополните пробирку индуцируемыми плазмидами, содержащими интересующий ген. Экспрессия этого гена находится под контролем восходящей промоторной последовательности, слитой с оператором тетрациклина или TetO, образуя тетрациклин-чувствительный элемент или TRE.

Кроме того, добавьте регуляторные векторы без тетрациклина, каждый из которых содержит ген, кодирующий рекомбинантный трансактиваторный белок тетрациклина или tTA. Электропорируйте смесь клетки и ДНК с помощью электрических импульсов для облегчения поглощения плазмид клеткой.

После электропорации поместите клетки в планшеты и инкубируйте в течение желаемого периода времени. При попадании в ядро вектор тетрациклин-офф экспрессирует белок tTA. tTA представляет собой гибридный белок, содержащий репрессор Tet, или группу TetR, и трансактиваторный домен вирусной транскрипции VP16.

Фрагмент TetR связывается с последовательностью TetO элемента TRE, в то время как домен VP16 позволяет РНК-полимеразе синтезировать мРНК из нижележащей ДНК, что в конечном итоге приводит к экспрессии генов. Замените питательную среду в культуральной пластине на доксициклинсодержащую ср