Морфолино-опосредованное редактирование генов: техника нокдауна генов с использованием блокирующих трансляцию морфолигонуклеотидов в одноклеточных яйцах пещерных рыб

Морфолино представляют собой короткие, одноцепочечные модифицированные олигонуклеотиды с различиями в их фосфатной основе и структуре сахара по сравнению с природными нуклеотидами. Эти особенности повышают стабильность морфолино при физиологическом pH. Несмотря на эти вариации, морфолино содержат стандартные нуклеотиды, которые помогают в разработке олигонуклеотидов, комплементарных специфической последовательности мРНК из желаемого гена-мишени, который должен быть уничтожен.

Чтобы выполнить редактирование генов, вызванное морфолино, начните с взятия одноклеточных икринок пещерных рыб, помещенных в лунки агарозной инъекционной пластины. Визуализируйте полупрозрачные и круглые яйца, чтобы найти желточный мешок - заполненную жидкостью структуру, присутствующую внутри яйца.

Возьмите иглу для микроинъекций, предварительно заполненную раствором, содержащим разработанный морфолино. Введите раствор непосредственно в яичный желток, обеспечив попадание морфолино в цитоплазму клетки. Внутри клеток ген-мишень образует мРНК, которая транспортируется в цитоплазму.

В цитоплазме вводимый морфолино гибридизуется со своим комплементарным транскриптом мРНК-мишени в эндогенном месте инициации и выход