Морфолино-опосредованное редактирование генов: техника нокдауна генов с использованием блокирующих трансляцию морфолигонуклеотидов в одноклеточных яйцах пещерных рыб

Морфолино представляют собой короткие, одноцепочечные модифицированные олигонуклеотиды с различиями в их фосфатной основе и структуре сахара по сравнению с природными нуклеотидами. Эти особенности повышают стабильность морфолино при физиологическом pH. Несмотря на эти вариации, морфолино содержат стандартные нуклеотиды, которые помогают в разработке олигонуклеотидов, комплементарных специфической последовательности мРНК из желаемого гена-мишени, который должен быть уничтожен.

Чтобы выполнить редактирование генов, вызванное морфолино, начните с взятия одноклеточных икринок пещерных рыб, помещенных в лунки агарозной инъекционной пластины. Визуализируйте полупрозрачные и круглые яйца, чтобы найти желточный мешок - заполненную жидкостью структуру, присутствующую внутри яйца.

Возьмите иглу для микроинъекций, предварительно заполненную раствором, содержащим разработанный морфолино. Введите раствор непосредственно в яичный желток, обеспечив попадание морфолино в цитоплазму клетки. Внутри клеток ген-мишень образует мРНК, которая транспортируется в цитоплазму.

В цитоплазме вводимый морфолино гибридизуется со своим комплементарным транскриптом мРНК-мишени в эндогенном месте инициации и выходит за его пределы. Этот процесс блокирует связывание более крупной субъединицы рибосомы с зарождающимся комплексом инициации трансляции, состоящим из небольших рибосомных субъединиц, объединенных с некоторыми специфическими белками.

В последующем прогрессирование комплекса инициации трансляции стерически затрудняется, что останавливает трансляцию мРНК в белок. Наконец, концентрация целевого белка снижается из-за блокировки трансляции морфолиносом.

В день инъекции используйте стеклянную пипетку для переноса одноклеточных яиц в инъекционную пластину, заполняя до пяти рядов инъекционной пластины от 30 до 40 яиц в ряду. Держите икру увлажненной с помощью небольшого количества воды рыбной системы. Разморозьте морфолино на льду и приготовьте раствор для инъекций так, чтобы на одно яйцо было введено 400 пикограмм морфолино, используя длинный наконечник пипетки Microloader или добавив от 2 до 4 микролитров болюса до конца.

Когда все иглы будут загружены, используйте щипцы, чтобы обрезать лишнюю длину от кончиков инъекционных игл, и вставьте первую иглу в микроманипулятор, подключенный к микроинъектору пиколитера. Затем поместите чашку для инъекций под препарирующий микроскоп и с помощью микроманипулятора проникните иглой в каждое яйцо, прежде чем ввести 1 нанолитр раствора для инъекций морфолина непосредственно в желток.