Энциклопедия экспериментов JoVE
Биологические методы
0 просмотров • 5:40 мин. • July 8th, 2025
Начните с жизнеспособных эмбрионов данио-рерио на стадии одной клетки, помещенных в лунки формы для микроинъекций.
Загрузите в иглу для микроинъекций раствор, содержащий мРНК Tol2-транспозазу, кодирующую и донорские плазмиды транспозона. Плазмиды включают в себя вездесущий промотор данио-рерио и флуоресцентный ген, кодирующий белки, окруженный транспозонными плечами Tol2.
Осторожно введите раствор для микроинъекций в цитоплазму эмбриона рыбки данио. Внутри клетки мРНК Tol2-транспозазы транслируются в белки Tol2-транспозазы и активно транспортируются в ядро.
Сайты Tol2 на донорской плазмиде содержат специфические инвертированные концевые повторы, или ITR, фланкирующие репортерный ген. РМЭ окружены короткими прямыми повторами. Белки транспозазы распознают и связываются с сайтами ITR, образуя шпильку на фланкирующей ДНК. Транспозазы далее расщепляют конструкцию транспозона от фланкирующей ДНК, высвобождая ее из плазмиды и оставляя после себя короткие прямые повторы.
Транспозазы создают ступенчатый двухцепочечный разрыв в геноме соматической клетки и встраивают конструкцию транспозона в сайт генома. Заполнение зазоров ступенчатых концов ДНК-полимеразой с последующим лигированием зазубр
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео