Tol2 транспозон-опосредованный трансгенез данио-рерио: процедура получения трансгенных данио-рерио после совместной инъекции системы Tol2 в оплодотворенные эмбрионы данио-рерио

Начните с жизнеспособных эмбрионов данио-рерио на стадии одной клетки, помещенных в лунки формы для микроинъекций.

Загрузите в иглу для микроинъекций раствор, содержащий мРНК Tol2-транспозазу, кодирующую и донорские плазмиды транспозона. Плазмиды включают в себя вездесущий промотор данио-рерио и флуоресцентный ген, кодирующий белки, окруженный транспозонными плечами Tol2.

Осторожно введите раствор для микроинъекций в цитоплазму эмбриона рыбки данио. Внутри клетки мРНК Tol2-транспозазы транслируются в белки Tol2-транспозазы и активно транспортируются в ядро.

Сайты Tol2 на донорской плазмиде содержат специфические инвертированные концевые повторы, или ITR, фланкирующие репортерный ген. РМЭ окружены короткими прямыми повторами. Белки транспозазы распознают и связываются с сайтами ITR, образуя шпильку на фланкирующей ДНК. Транспозазы далее расщепляют конструкцию транспозона от фланкирующей ДНК, высвобождая ее из плазмиды и оставляя после себя короткие прямые повторы.

Транспозазы создают ступенчатый двухцепочечный разрыв в геноме соматической клетки и встраивают конструкцию транспозона в сайт генома. Заполнение зазоров ступенчатых концов ДНК-полимеразой с последующим лигированием зазубрин создает короткие прямые повторы.

Лигирование вызывает стабильную интеграцию транспозонной конструкции в геном соматической клетки, а промотор способствует экспрессии флуоресцентных белков. Инкубируйте введенные эмбрионы. Во время эмбрионального развития соматические клетки дают начало различным типам клеток и создают трансгенных рыбок данио.

После приготовления мРНК транспозазы Tol2 и раствора для инъекций, согласно текстовому протоколу, за день до инъекции установили от четырех до шести резервуаров для разведения, в которых было не менее двух самцов и двух самок. Чтобы уменьшить количество отходов жизнедеятельности рыбы и вызвать реакцию размножения, избегайте кормления рыб во второй половине дня.

На следующее утро достаньте приготовленный раствор для инъекций из морозильной камеры с отрицательными температурами 80 градусов Цельсия и положите его на лед. Потяните за разделители в резервуарах для разведения рыб и дайте рыбам возможность спариваться. Как правило, рыбы откладывают икру в течение 20-30 минут.

Во время ожидания с помощью съемника микропипетки со следующими параметрами вытащите иглы из капиллярного стекла. С помощью лабораторной салфетки сломайте конец иглы и создайте скошенный край. Меньший диаметр предпочтителен для снижения смертности эмбрионов.

Как только рыбы снесут икру, соберите их в чашку Петри диаметром 10 сантиметров. Сразу под микроскопом вскрытия удалите все аномальные эмбрионы и отходы жизнедеятельности рыб. Затем пипеткой поместите оплодотворенные эмбрионы в подготовленную форму для литья под давлением из 3% агарозы. Удалите лишнюю воду, чтобы сохранить эмбрионы на месте.

Как только все ряды будут заполнены жизнеспособными эмбрионами, расположите их так, чтобы все отдельные клетки были ориентированы под углом 45 градусов по горизонтали по отношению к игле. Это значительно облегчит укол в дальнейшем. Далее, надев перчатки, с помощью 20-микролитрового загрузочного наконечника пипетки удалите 5 микролитров подготовленного конструктива из пробирки на лед.

Осторожно вставьте наконечник пипетки в задний конец разорванной капиллярной трубки так, чтобы он начал сужаться, чтобы реагент оказался как можно ближе к наконечнику, и вытолкните его в капилляр. Если пузырьки воздуха все еще остались, встряхните иглу, следя за тем, чтобы не сломать кончик.

Вставьте иглу прямо в иглодержатель для микроинъекций и осторожно затяните, пока игла не останется на месте, затем отрегулируйте угол примерно до 45 градусов. После того, как игла подготовлена и прикреплена, включите микроскоп и баллон с газовым давлением. Отрегулируйте объем впрыска, используя приблизительно 0,5 фунта на квадратный дюйм для удержания и 30 фунтов на квадратный дюйм для выброса.

Убедитесь, что раствор выбрасывается из иглы при нажатии на педаль. С помощью ступенчатого микрометра с каплей минерального масла отрегулируйте объем и расход раствора примерно до 10 микрометров в диаметре. Следите за тем, чтобы противодавление позволяло небольшому количеству раствора вытекать из иглы.

Если противодавления недостаточно, капиллярное действие приведет к попаданию жидкости в иглу и разрушению мРНК. После калибровки иглы вставьте иглу в одну клетку оплодотворенных эмбрионов, используя край гелевой выемки, чтобы обеспечить подложку, которая удерживает эмбрион на месте и позволяет игле оказывать давление, не перемещая эмбрион.

Как только кончик иглы окажется в одной ячейке, нажмите на педаль, чтобы выпустить нужное количество раствора. Важно вводить в клетку раствор, а не желток для получения трансгенных рыбок данио. Повторите этот процесс для всех эмбрионов.

По завершении используйте одноразовую пипетку объемом 3,4 миллилитра и воду для рыбной системы, чтобы перенести введенные эмбрионы в промаркированную чашку, промыв их из агарозного выреза. Храните эмбрионы в инкубаторе при температуре 28,5 градусов Цельсия, чтобы они могли развиваться.