Энциклопедия экспериментов JoVE
Биологические методы
0 просмотров • 3:29 мин. • July 8th, 2025
Начните с суспензии индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток, ИПСК, в подходящем буфере для электропорации. Добавьте раствор, состоящий из плазмид, кодирующих транспозазу PiggyBac, и донорских плазмид. Электропорировать смесь.
Электрические импульсы временно проникают в клеточные мембраны, способствуя клеточному поглощению плазмид. Донорские плазмиды содержат транспозон-специфичные инвертированные концевые повторы, ITR, которые являются инвертированными комплементами друг друга, окруженными TTAA-повторами, заключающими в скобки целевой белок и гены устойчивости к антибиотикам.
Экспрессированные белки транспозазы PiggyBac создают зазубрины на 3'-концах ITR, внутренние по отношению к TTAA-повторам. Обнаженные 3'-гидроксильные группы атакуют нуклеотид комплементарной цепи внутри фланкирующей ДНК, образуя шпильки TTAA на концах транспозонов, тем самым высвобождая конструкцию транспозона из плазмиды.
Транспозазы разрешают шпильки с образованием выступов TTAA на 5' концах конструкции транспозона. Транспозазы в дальнейшем создают двухцепочечные разрывы в последовательности TTAA в геноме хозяина. Высвобожденные концы 3'-гидроксильного транспозона атакуют последовательность
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео