JoVE Encyclopedia of Experiments
Биологические методы
0 просмотров • 4:15 мин • July 8th, 2025
Сульфатированные гликозаминогликаны, такие как гепарансульфаты, ГС, представляют собой отрицательно заряженные, линейные, сульфатированные полисахариды переменной длины цепи, прикрепленные к белкам клеточной поверхности.
Чтобы оценить ГС разной длины, выделенные из легочной ткани мыши, начните со сборки гелевой кассеты. Частично заполните его высококонцентрированным акриламид-бисакриламидным раствором, включающим катализирующие агенты - персульфат аммония и тетра-метил-этилен-диамин. Покройте водой, чтобы предотвратить контакт с воздухом, который может препятствовать полимеризации. Инкубировать.
Катализирующие агенты индуцируют акриламид-бисакриламидную полимеризацию, образуя мелкопористый разрешающий гель. Слейте воду. Добавьте низкую концентрацию акриламид-бисакриламидного раствора с катализирующими агентами. Вставьте гелевую расческу для создания лунок. Раствор полимеризуется, образуя гель с большими порами.
Загрузите камеры резервуара для электрофореза рабочим буфером для обеспечения оптимальной электропроводности во время электрофореза.
Растворите смесь HS в загрузочном буфере, содержащем трекинговый краситель и сахарозу. Далее переложите эту смесь и стандартные лестницы HS в кассетные лунки. Сахароза ограничивает смесь в лунках. Краситель помогает контролировать прогрессирование электрофореза.
Инициируйте электрофорез при низком напряжении. Отрицательно заряженные ГС пересекают укладывающийся гель, двигаясь к положительно заряженному аноду, и концентрируются на границе раздела укладывающего и разрешающего геля из-за разницы в размерах пор.
Увеличьте напряжение. Малоцепочечные ГМ быстро мигрируют через разрешающий гель, проходя дальше, в то время как длинноцепочечные ГС попадают в гелевую матрицу и движутся медленно.
После электрофореза окрашиваем гель. HS представлены в виде отдельных полос, при этом малоцепочечные HS расположены ниже, чем длинноцепочечные HS. Длина отдельных HS может быть определена путем сравнения со стандартами HS.
Начните с установки пустой кассеты в бак PAGE. Отлите разрешающий гель, смешав 10 миллилитров раствора разрешающего геля с 60 микролитрами свежеприготовленного 10% персульфата аммония в 15-миллилитровой тубе. Затем добавьте 10 микролитров TEMED. Аккуратно переверните трубку 2-3 раза.
Быстро добавьте в кассету 10 миллилитров активированного раствора полиакриламидного геля с помощью пипетки. Посыпьте 2 миллилитрами деионизированной отфильтрованной воды и дайте растворяющему гелю полимеризоваться в течение 30 минут.
После того как разрешающий гель полностью полимеризуется, выбросьте наложенную воду. Отлите укладывающий гель, смешав 3 миллилитра раствора стекеля с 90 микролитрами свежеприготовленного 10% персульфата аммония в 15-миллилитровой пробирке. Затем добавьте 3 микролитра TEMED и аккуратно переверните трубку 2-3 раза.
С помощью пипетки быстро нанесите укладывающийся раствор геля на затвердевший разрешающий гель, пока кассета не заполнится до краев. Полностью вставьте расческу, входящую в комплект поставки с пустой кассетой для полиакриламидного геля, и дайте стекируемому гелю полимеризоваться в течение 30 минут. Как только гель полимеризуется, снимите полоску ленты со дна кассеты и поместите кассету обратно в узел бака PAGE. Заполните верхнюю и нижнюю камеры соответствующими буферными растворами.
Высушенные образцы гликозаминогликанов растворить в минимально необходимом объеме деионизированной, отфильтрованной воды и смешать с буфером для загрузки образца в соотношении 1 к 1. Загрузите образцы и олигосахаридные лестницы HS в гель.
Повторно запустите гель в течение 5 минут при напряжении 100 вольт. Затем запустите его при напряжении 200 вольт в течение 20-100 минут, в зависимости от процентного содержания акриламида в растворе разрешающего геля.