Электрофорез полиакриламидного геля додецилсульфата натрия для анализа белков: метод разделения и визуализации белков на основе молекулярной массы

Начните с обработки образца белка денатурирующим буфером, содержащим детергент - додецилсульфат натрия, SDS, и восстановитель - бета-меркаптоэтанол. Слегка нагрейте его. На этой стадии бета-меркаптоэтанол разрушает дисульфидные связи, придавая белку развернутую конформацию.

Развернутые белки с обнаженными гидрофобными аминокислотами связываются с отрицательно заряженными SDS и приобретают равномерный отрицательный заряд. Добавьте в образец подходящий следящий краситель для визуализации в режиме реального времени.

Теперь загрузите образец и стандартный маркер молекулярного размера в отдельные лунки, присутствующие в стекирующем геле - верхнем слое полиакриламидного геля, содержащем меньшую концентрацию сшитых акриламидных полимеров.

Подключите заполненный буфером гелевый аппарат к источнику питания.

В присутствии электрического поля отрицательно заряженные белки свободно мигрируют к аноду и укладываются вместе, чтобы войти в разрешающий гель — нижний слой, содержащий гель с более высокой концентрацией.

В рассасывающемся геле белки начинают мигрировать в соответствии с их молекулярным размером, при этом более мелкие белки мигрируют быстро, что приводит к оптимальному разрешению белковых полос. После этого остановите запуск и удалите гель.

Окрасьте гель анионным красителем Coomassie blue, который электростатически связывается с основными аминокислотами в белках, придавая им синюю окраску. После этого удалите пятна с геля в растворе уксусной кислоты для лучшей визуализации.

Удалите гель и определите разделенные белки на основе их предполагаемой молекулярной массы.

Приготовьте два разделительных геля, как описано в рукописи текста. Налейте гель между стеклянными пластинами с помощью пипетки объемом 1 миллитр, следя за тем, чтобы верхние 2 сантиметра были свободны от смеси. Добавьте 70% этанола поверх разделительного геля, создавая равномерную границу между двумя слоями.

После того, как разделительные гели полимеризуются, приготовьте укладывающиеся гели, следуя инструкциям в текстовой рукописи. Затем удалите этанол из разделительных гелей и добавьте раствор укладывающего геля. Осторожно вставьте расческу с нужным количеством карманов, не вводя пузырьков воздуха, и дайте гелю полимеризоваться в течение 20 – 30 минут.

Загрузите по 4 микролитра каждого образца, а также белковую лестницу, в отдельные лунки. Затем запустите гель в проточном буфере Tris-Glycine при напряжении 144 вольта в течение 45 минут при комнатной температуре. Используйте предварительно подогретый раствор Fairbanks A для окрашивания гелей на коромысле в течение 30 минут, а предварительно подогретый раствор Fairbanks D для обесцвечивания гелей на коромысле до тех пор, пока не будет достигнут желаемый фон.