JoVE Encyclopedia of Experiments
Биологические методы
0 просмотров • 5:34 мин • July 8th, 2025
Для начала возьмем образец, содержащий флуоресцентно меченные фосфорилированные и нефосфорилированные олигонуклеотиды РНК, смешанные с нагрузочным красителем, содержащим мочевину. Нагрейте образец.
Мочевина - прочный денатурант - в сочетании с теплом денатурирует структуру вторичной РНК, что приводит к ее линеаризованной и неструктурированной конформации. Теперь отливаем гель, смешивая акриламидно-бисакриламидный раствор с мочевиной.
Добавьте тетраметилендиамин, катализатор, и персульфат аммония, окислитель, чтобы облегчить последующую полимеризацию геля.
Перелейте раствор в заранее собранный кассетный аппарат. Вставьте гребень, создав лунки для загрузки пробы. Дайте гелю полимеризоваться. Поместите кассету в гелевый аппарат. Добавьте в верхний и нижний резервуары бегущий буфер, поддерживая протекание тока через весь гель. Снимите расческу.
Загрузите образец, смешанный с красителем для визуализации, в лунку и подключите гель к источнику питания с нужным напряжением. Мочевина в геле позволяет молекулам РНК мигрировать в виде линейных веществ.
Гель действует как сито, позволяя отрицательно заряженным молекулам РНК двигаться через поры к положительному электроду. Во время прогона фосфорилированная РНК, будучи по своей природе более негативной, движется быстрее, чем нефосфорилированная РНК.
Визуализируйте гель для обнаружения флуоресцентно меченой РНК. Обратите внимание на сдвиг подвижности между более быстро мигрирующей фосфорилированной РНК, которая выглядит как более низкая полоса по сравнению с нефосфорилированной РНК.
Чтобы приготовить 15% раствор денатурирующего акриламидного геля, смешайте 22,5 миллилитров предварительно смешанного 40% раствора акриламида/бис-акриламида 29:1, 6 миллилитров 10X TBE, 28,8 грамма мочевины и воды, не содержащей РНКазы, до общего объема 59 миллилитров. Затем аккуратно размешайте раствор.
Нагрейте раствор в микроволновке в течение 20 секунд, перемешайте его и сразу же верните в микроволновку еще на 20 секунд. Аккуратно размешайте раствор до полного растворения мочевины. Поместите стеклянный стакан в неглубокую водяную баню, содержащую холодную воду, на 5 минут, следя за тем, чтобы уровень холодной воды вокруг стеклянного стакана был выше уровня раствора внутри стеклянного стакана. Когда раствор остынет, отфильтруйте и дегазируйте его с помощью одноразовой фильтрующей установки с диаметром 0,22 микрометра для удаления твердых частиц и микроскопических пузырьков воздуха.
Короткую и длинную стеклянную тарелку вымойте водой с мылом. Затем распылите на каждую пластину 95% этанола и протрите стекло, чтобы удалить влагу. Поднимите длинную тарелку над столешницей, поставив ее на коробку. Затем расположите распорки 0,4 мм вдоль длинных краев пластины. Положите короткую пластину поверх длинной тарелки, убедившись, что края короткой пластины, длинной пластины и распорок выровнены. Затем зажмите каждую сторону тремя равномерно расположенными металлическими зажимами.
Добавьте в раствор акриламида 24 микролитра TEMED и перемешайте. Затем добавьте 600 микролитров 10% APS, и сразу же вылейте раствор между стеклянными пластинами.
Заливка акриламидного раствора между стеклянной пластиной может быть действительно сложной задачей. Чтобы избежать образования пузырьков воздуха, постукивайте по бутерброду со стеклянной тарелкой во время заливки раствора.
Осторожно добавьте чистую 32-луночную расческу в верхнюю часть стеклянной пластины и дайте акриламиду полимеризоваться в течение 30 минут.
Чтобы запустить гель, установите термоблок на 75 градусов Цельсия, снимите металлические хомуты, а также тщательно промойте и высушите стеклянную пластину. Поместите сэндвич с пластиной в гелевый аппарат короткой пластиной вперед и приготовьте рабочий буфер 0,5X TBE, смешав 100 миллилитров 10X TBE с 1,9 литрами воды, не содержащей РНКазы.
Добавьте 600 миллилитров бегового буфера в верхнюю и нижнюю камеры аппарата. Аккуратно извлеките расческу из геля и тщательно промойте лунки с помощью шприца. Предварительно запустите гель на 50 Вт в течение 30 минут. Затем снова промойте лунки.
Пульсируйте погасшие реакции, и инкубируйте их при температуре 75 градусов Цельсия в течение 3 минут. Повторите импульсный отжим и сразу же загрузите по 10 микролитров каждого образца в гель. Затем запустите гель в течение 3 часов при мощности 50 Вт. Когда прогон закончится, выключите электропитание и осушите верхнюю камеру аппарата.
Вымойте и высушите внешнюю сторону стеклянной тарелки бутерброда. Затем накройте его фольгой и перенесите на лазерный сканер для визуализации. Установите сэндвич со стеклянной пластиной на столик лазерного сканера, установите длины волн возбуждения и излучения для нужного флуорофора и получите изображение геля.