Двумерный электрофорез в полуденатурирующем агарозном геле: методика разделения полиморфных волокон амилоидов на основе размерной неоднородности

Амилоидные волокна представляют собой агрегаты неправильно свернутых белков, которые демонстрируют неоднородность по размеру. Эти волокна, будучи устойчивыми к анионным моющим средствам, таким как SDS, могут быть проанализированы с помощью двумерного электрофореза на основе полуденатурирующего агарозного геля.

Для начала возьмите предварительно собранный агарозный гель размером с большие поры, который содержит SDS. Высокая пористость позволяет отделять неповрежденные волокна во время работы. Наложите на гель работающий буфер, содержащий SDS.

Загрузите в гель лизат клеток, содержащий амилоидные волокна. Наличие SDS и отсутствие стадии нагрева образца создает условия полуденатурации, в которых моющее средство связывается с высокостойкими амилоидами, придавая равномерный отрицательный заряд неповрежденным волокнам.

Запустите гель в первом измерении при соответствующем напряжении. Электрическое поле вызывает миграцию отрицательно заряженных амилоидов к положительно заряженному аноду.

Во время прогона более мелкие волокна мигрируют быстрее по сравнению с более крупными, образуя мазкообразный полосовой рисунок, указывающий на неоднородность размеров.

По завершении поверните гель перпендикулярно и запустите его во втором измерении. В этом измерении волокна движутся идентично первому прогону, разделяясь в зависимости от их размеров. Это создает диагональное размазывание, поскольку более мелкие волокна мигрируют быстрее, чем крупные.

Образование острой диагональной полосы подтверждает наличие интактной, но неоднородной популяции амилоидных фибрилляров.

Для приготовления геля добавьте 2 грамма порошка агарозы на 200 миллилитров буфера TAE в стеклянной стаканке. Затем нагрейте стакан в микроволновой печи, чтобы агароза расплавилась.

Далее добавьте 1 миллилитр 20% SDS до конечной концентрации 0,1%. Аккуратно взболтайте стакан.

Далее вылейте жидкую агарозу на гелевую плиту размером 15 см х 14 см. Чтобы удалить пузырьки воздуха, используйте пипетку объемом 1 миллилитр. Затем нанесите на гель расческу на 20 лунок.

Затем добавьте примерно 60 микрограммов лизата цельных клеток в крайнюю правую полосу геля. Запустите гель при напряжении 60 вольт в течение примерно четырех часов, используя буфер TAE, содержащий 0,1% SDS, в качестве рабочего буфера.

Чтобы запустить гель во втором измерении, осторожно поверните гель на 90 градусов против часовой стрелки. Затем включите тюрьму при напряжении 60 вольт в течение примерно четырех часов.