JoVE Encyclopedia of Experiments
Биологические методы
0 просмотров • 3:29 мин • July 8th, 2025
Чтобы определить размер фрагментов ДНК с помощью капиллярного электрофореза, начните с взятия многолуночного аналограммы. Каждая лунка содержит флуоресцентно меченные, разного размера ампликоны ПЦР – двухцепочечные олигонуклеотиды ДНК, полученные после цикла ПЦР.
Добавьте в лунку несколько двухцепочечных фрагментов ДНК разного размера, которые действуют как стандарт размера. Каждая из этих молекул ДНК несет флуоресцентную метку для легкой идентификации.
Дополните лунку формамидом, крепким денатурантом, и нагрейте при высокой температуре. На этом этапе происходит денатурация ДНК, образуя одноцепочечные фрагменты, которые могут легко мигрировать через гелевые поры.
Поместите пластину в блок анализатора фрагментов, который содержит предварительно введенный полимерный гель внутри его капиллярной системы.
Подайте высоковольтное усилие для электрокинетического введения ДНК из лунки в капилляр тонкого диаметра на катоде - отрицательном конце. Отрицательно заряженные молекулы ДНК мигрируют к положительно заряженному аноду. Более короткие нити ДНК сталкиваются с меньшей силой трения и быстрее перемещаются через гель, чем более длинные нити ДНК.
Во время электромиграции ДНК пересекает путь лазерного луча, что приводит к флуоресцированию красителя. Сигналы излучения от красителя улавливаются детектором и затем транслируются в электроферограмму — график, представляющий каждую флуоресцентную ДНК в виде отдельного пика разного цвета.
Сравните пик неизвестного фрагмента ДНК с эталонными пиками, чтобы проанализировать его размер.
После подтверждения ампликонов ПЦР используйте новые полоски или планшеты для ПЦР, чтобы разбавить продукты ПЦР от 1 до 10 в очищенной воде. Вортекс и центрифуга кратко. Работая в вытяжном шкафу, приготовьте в центрифужной пробирке мастер-смесь, состоящую из формамида и стандартного раствора эталонного размера.
В зависимости от количества анализируемых ПЦР-продуктов используйте объемы реагентов, как подробно описано в рукописи. Оставьте 10% избыточного объема.
Вортексируйте на короткое время и распределите 9,5 микролитров по отдельным лункам на ПЦР-планшете, подходящем для имеющейся системы капиллярного электрофореза. Затем добавьте 0,5 микролитра разведенного ПЦР-продукта. Запечатайте и быстро центрифугируйте.
Затем загрузите планшет с образцами в термоциклер для ПЦР и денатурируйте образцы при температуре 95 градусов Цельсия в течение 3 минут, прежде чем охладить до 4 градусов Цельсия на неопределенный срок. Центрифугируйте при давлении 1 000 x g в течение 1 минуты. Осторожно снимите пломбу и установите пластину на калиброванную систему капиллярного электрофореза в соответствии с инструкциями производителя.
Проведите анализ фрагментов капиллярного электрофореза с использованием реагентов в соответствии с выбранным аппаратом и отрегулируйте условия работы в соответствии с описанием в рукописи.