Щелочной гель-электрофорез: чувствительный метод количественной оценки повреждения ДНК в отдельных раковых клетках после химиотерапии
JoVE Encyclopedia of Experiments
Биологические методы
0 просмотров • 5:06 мин • July 8th, 2025
Химиотерапевтические препараты вызывают одно- и двухцепочечные разрывы ДНК в раковых клетках, вызывая повреждение ДНК и гибель клеток.
Чтобы количественно оценить повреждение ДНК, смешайте обработанные химиотерапией раковые клетки с расплавленной легкоплавкой агарозой. Нанесите эту смесь пипеткой на предметные стекла с предварительно покрытым агарозой покрытием. Дайте расплавленной агарозе застыть, встраивая клетки в пористую гелевую матрицу.
Обработать лизисным буфером, содержащим высокие концентрации моющих средств и солей. Детергенты растворяют клеточные и ядерные мембраны. Кроме того, высокое содержание соли отделяет гистоновые белки от ДНК, оставляя суперспиральную ДНК, прикрепленную к ядерной матрице.
Инкубировать в щелочном буфере для электрофореза. Щелочная среда заставляет суперспирали ДНК раскручиваться, обнажая одноцепочечные и двухцепочечные разрывы ДНК.
Поместите предметные стекла в гелевый лоток с буфером для электрофореза. Инициируйте электрофорез.
Будучи отрицательно заряженной, ДНК притягивается к положительному аноду. Поврежденные фрагменты ДНК мигрируют из ядра и путешествуют через пористую гелевую матрицу, при этом более длинные фрагменты движутся медленнее, чем более короткие. Напротив, неповрежденная ДНК не мигрирует легко, оставаясь в ядре.
После электрофореза окрашивайте клетки раствором красителя флуоресцентной нуклеиновой кислоты. Молекулы красителя связываются с ДНК.
Под флуоресцентным микроскопом отдельные клетки, содержащие поврежденную ДНК, демонстрируют флуоресцентную кометную структуру. «Голова» кометы представляет собой неповрежденную ДНК, в то время как «хвост» состоит из поврежденных фрагментов ДНК.
Длина и интенсивность «хвоста» кометы указывают на степень повреждения ДНК в отдельных раковых клетках, обработанных химиотерапией.
Соедините клеточную суспензию с 1% расплавленным агарозой с низкой температурой плавления, в объемном соотношении 1:10. Аккуратно перемешайте, пипетируя вверх и вниз, и сразу же нанесите пипетку 30 микролитров на предметное стекло. Используйте боковую сторону наконечника пипетки для распределения агарозно-клеточной смеси, чтобы обеспечить образование тонкого слоя. Поместите предметные стекла на плоскую поверхность при температуре 4 градуса Цельсия в темноту на 10 минут. Погрузите предметные стекла в раствор лизиса 4 градуса Цельсия, в темноте на час или на ночь.
Для анализа щелочной кометы аккуратно удалите предметные стекла из раствора для лизиса, слейте лишнюю жидкость и осторожно погрузите предметные стекла в AES в темноте при температуре 4 градуса Цельсия на один час, чтобы позволить ДНК раскрутиться.
Добавьте предварительно охлажденный AES в лоток для предметного стекла для электрофореза. Не превышайте 0,5 сантиметра над горками. Поместите горки внутрь, и накройте крышкой. Установите напряжение источника питания на 1 вольт на сантиметр и работайте при температуре 4 градуса Цельсия в течение 30 минут. Когда электрофорез будет завершен, слейте излишки AES со стекол.
Осторожно погрузите горки дважды, в дистиллированную воду комнатной температуры, каждый раз на пять минут. После этого аккуратно погрузите горки в 70% этанол комнатной температуры на пять минут.
Начните процедуру окрашивания с сушки предметных стекол в темноте при температуре 37 градусов Цельсия в течение 10-15 минут. Далее нанесите от 50 до 100 микролитров зеленого флуоресцентного раствора для окрашивания нуклеиновых кислот на высушенную агарозу каждого предметного стекла и окрашивайте в течение 15 минут при комнатной температуре в темноте. Кратко промойте предметные стекла в дистиллированной воде и полностью высушите при температуре 37 градусов Цельсия в темноте.
Обзор
В данной статье описывается метод количественного определения повреждений ДНК в раковых клетках, вызванных химиотерапевтическими препаратами. Метод основан на использовании щелочного кометного анализа, который позволяет визуализировать разрывы ДНК с помощью электрофореза.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Клеточная биология
- Исследования рака
Теоретические основы
- Химиотерапия может вызвать значительные повреждения ДНК в раковых клетках.
- Понимание механизмов повреждения ДНК имеет решающее значение для оценки эффективности лечения.
- Щелочной метод кометного анализа является чувствительным способом обнаружения разрывов цепей ДНК.
- Данный анализ позволяет визуализировать повреждения ДНК на уровне отдельных клеток.
Цель исследования
- Количественно оценить степень повреждения ДНК в раковых клетках, подвергнутых химиотерапии.
- Продемонстрировать применение метода щелочного электрофореза одноклеточных молекул ДНК (комета-анализа) для оценки целостности ДНК.
- Предоставить подробный протокол для воспроизведения данного анализа исследователями.
Используемые методы
- Смешивание клеток, подвергнутых химиотерапии, с низкоплавким агарозом.
- Инкапсуляция клеток в агарозе на предметных стеклах.
- Обработка лизирующим буфером для солюбилизации мембран и удаления гистонов.
- Проведение электрофореза для разделения фрагментов ДНК по размеру.
Основные результаты
- Поврежденная ДНК мигрирует из ядра во время электрофореза.
- Флуоресцентное окрашивание выявляет структуры в виде комет, указывающие на повреждение ДНК.
- Длина и интенсивность «хвостов» комет коррелируют со степенью повреждения ДНК.
- Данный анализ эффективно позволяет отличить поврежденную ДНК от неповрежденной.
Заключение
- Щелочной метод кометного анализа является надежным способом оценки повреждения ДНК.
- Данный метод может быть использован для оценки эффективности химиотерапевтических препаратов.
- Дальнейшие исследования могут углубить понимание механизмов репарации ДНК в раковых клетках.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для отрасли
Количественная оценка повреждений ДНК на уровне отдельных клеток имеет решающее значение для анализа эффективности химиотерапии и механизмов снижения рисков при поиске онкологических препаратов. Метод ДНК-комет в щелочных условиях позволяет проводить высокочувствительное обнаружение как одно-, так и двухцепочечных разрывов ДНК, что повышает прогностическую уверенность при оценке соединений на ранних стадиях. Эта возможность позволяет принимать решения о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) и проводить сортировку портфеля препаратов, предоставляя прямые доказательства активности воздействия на ДНК в раковых клетках.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Позволяет напрямую количественно оценивать разрывы цепей ДНК, вызванные исследуемыми соединениями.
- Способствует механистическому снижению рисков за счет разграничения одноцепочечных и двухцепочечных повреждений ДНК.
- Предоставляет функциональные доказательства взаимодействия с мишенью при разработке агентов, повреждающих ДНК.
- Повышает прогностическую уверенность при выборе соединений для дальнейшей разработки.
Скрининг и разработка анализа
- Обеспечивает стандартизированные количественные показатели повреждения ДНК для валидации анализа.
- Поддерживает воспроизводимость и масштабируемость рабочих процессов скрининга на генотоксичность.
- Позволяет проводить надежное сравнение повреждений ДНК, вызванных соединениями, при различных условиях.
- Подготавливает валидированные биологические системы для последующего механистического или фенотипического скрининга.
Трансляционные и доклинические исследования
- Приводит количественную оценку повреждений ДНК в соответствие со стратегиями трансляционных биомаркеров в онкологии.
- Обеспечивает преемственность от этапа поиска in vitro до валидации на доклинических моделях.
- Позволяет принимать обоснованные с учетом рисков решения о дальнейшем продвижении на основе пороговых значений повреждения ДНК.
- Предоставляет механистические данные для поддержки трансляционных исследований путей репарации ДНК.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Щелочной метод кометного анализа интегрируется в континуум от этапа открытия до доклинических исследований, связывая ранние механистические исследования с трансляционными исследованиями в онкологических портфелях.
- Биология открытий: позволяет проверять гипотезы о механизмах воздействия на ДНК и уточнять сигнальные пути.
- Скрининг: обеспечивает получение количественных и воспроизводимых результатов для оценки генотоксичности соединений.
- Аналитика: позволяет получать измеримые данные о длине и интенсивности «хвоста» кометы для статистического сравнения.
- Трансляционные исследования: способствуют согласованию биомаркеров и доклинической валидации ответов на повреждение ДНК.
- Корпоративное использование: служит многократно используемой платформой для количественного определения повреждений ДНК в рамках различных онкологических программ.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает прогностическую уверенность и снижает механистическую неоднозначность при оценке повреждений ДНК.
- Операционная ценность: Стандартизирует рабочие процессы и повышает воспроизводимость количественного определения повреждений ДНК.
- Стратегическая ценность: Улучшает процесс принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) и распределение капитала в онкологических исследованиях.
- Влияние на портфель: Обеспечивает приоритизацию агентов, повреждающих ДНК, с учетом рисков и поддерживает сопоставимость данных между различными программами.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы в области электрофореза единичных клеток и флуоресцентной микроскопии.
- Необходим доступ к оборудованию для электрофореза и инфраструктуре для визуализации.
- Требуется межкомандная стандартизация условий анализа и параметров обработки данных.
- Метод применим к различным моделям раковых клеток при условии оптимизации протокола.
- Потенциальные ограничения включают вариативность при работе с образцами и необходимость тщательной подготовки предметных стекол.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
В Vivo щелочной Comet Assay и энзим-модифицированной щелочной Comet Анализ для Измерение разрывов ДНК и окислительный ДНК повреждений в печени крысы
Похожие видео
0 Просмотры
Оценки целостности ДНК стволовых клеток для сердечно клеточной терапии
Похожие видео
0 Просмотры
Использование замороженных тканей в ассе кометы для оценки повреждения ДНК
Похожие видео
0 Просмотры
Кометный анализ для выявления повреждений ДНК в клетках
Похожие видео
0 Просмотры
CometChip: Высокая пропускная 96-Ну Платформа для измерения повреждений ДНК в Microarrayed клетках человека
Похожие видео
0 Просмотры
Оценки в Vitro повреждения ДНК, используя Assay комета
Похожие видео
0 Просмотры
Специфический цикл клеток Измерение З2АКС и Апоптоза после генотоксического стресса с помощью цитометрии потока
Похожие видео
0 Просмотры
Высокопроизводительный подход к кометному анализу для оценки повреждения клеточной ДНК
Похожие видео
0 Просмотры
Демонстрация анализа ДНК-волокна для исследования повреждений ДНК и динамики репарации, индуцированной наночастицами
Похожие видео
0 Просмотры
Обнаружение разрывов ДНК в делящихся клетках человека с помощью анализа на нейтральную комету
Похожие видео
0 Просмотры
Последнее обновление: 22 августа 2026