JoVE Encyclopedia of Experiments
Биологические методы
0 просмотров • 4:21 мин • July 8th, 2025
Микрофлюидный электрофорез — это метод разделения фрагментов ДНК разного размера в микрокапиллярах.
Для начала возьмем многолуночный микрофлюидный чип с выделенными лунками для смеси полимера на основе геля и флуоресцентного красителя, образцы ДНК и известную молекулярную лестницу ДНК. Эти скважины соединены между собой сетью микроканалов.
Дозируйте гель-красящую смесь в отведенные лунки. Соберите чип на грунтовочной станции, предварительно оснащенной пустым шприцем. Надавите на поршень шприца, оказывая давление, чтобы принудительно ввести смесь геля и красителя в разделительный микроканал
.Извлеките чип и внесите пипетку в соответствующие лунки. Добавьте маркер - внутренний стандарт, который калибрует размер образца - в лунки, содержащие лестницу и образцы.
Вставьте микросхему в анализатор фрагментов, чтобы запустить микросхему. Оказавшись внутри, приложенное напряжение генерирует электрофоретические силы, которые направляют образец из лунки в микроканал для загрузки пробы, откуда он достигает пересечения между этим каналом и разделительным каналом. Электрический ток помогает пробе поступать в разделительный микроканал
.Молекулы флуоресцентного красителя интеркалируют отрицательно заряженные фрагменты ДНК, которые движутся к аноду с различными электрофоретическими скоростями относительно их молекулярного размера — более мелкие фрагменты мигрируют быстрее, чем большие. Следовательно, фрагменты разделяются на полосы разного размера, которые флуоресцируют.
Лазерный детектор измеряет флуоресценцию каждой полосы и записывает ее в виде электроферограммы, которая отображает ДНК разного размера в виде отдельного пика.
Перед началом работы доведите концентрат ДНК-красителя, гелевую матрицу ДНК, маркер ДНК, лестницу ДНК и очищенные образцы ДНК до комнатной температуры. Установите станцию грунтовки, заменив шприц и отрегулировав опорную плиту. Затем отпустите рычаг зажима шприца и сдвиньте его в верхнее положение.
Запустите программное обеспечение для определения размеров и приготовьте смесь геля и красителя. Ввергните концентрат красителя в течение 10 секунд и раскрутите его. Затем добавьте 25 микролитров красителя в флакон с гелевой матрицей и перемешайте раствор.
Переложите смесь геля и красителя в отжимной фильтр. Поместите его в центрифугу и вращайте в течение 10 минут при 1500 умноженных на избление. Когда смесь гель-краситель будет готова загрузиться, вставьте новый чип ДНК в станцию прайминга и добавьте 9 микролитров смеси гель-красителя в лунку, обозначенную буквой «G».
Закройте станцию заправки и убедитесь, что поршень расположен на отметке 1 миллитр. Нажмите на поршень шприца вниз, пока он не будет удерживаться зажимом. Подождите ровно 30 секунд, а затем отпустите зажим. Подождите еще 5 секунд, а затем медленно потяните поршень обратно в положение 1-миллилитр.
Откройте станцию грунтовки, и добавьте 9 микролитров гель-красящей смеси в лунки, отмеченные буквой «G». Добавьте 5 микролитров маркера в лунку, отмеченную символом лестницы, и в каждую из 12 лунок для пробы.
Добавьте 1 мклитр трапа в лунку с символом лестницы, а в лунки для проб – 1 мкл продукта ПЦР или воды. Переведите микросхему на 1 минуту до 2 400 оборотов в минуту. Вставьте его в биоанализатор, и запустите чип в течение пяти минут.