Невосстановительный SDS Page: Метод анализа дисульфид-связанных мультимерных белковых комплексов

Мультимерные белки стабилизируются межмолекулярными, ковалентными, дисульфидными связями между их цистеиновыми остатками, что имеет решающее значение для поддержания их структурной и функциональной целостности.

Для анализа таких комплексов с помощью невосстановительного ПЕЙДЖ берут нужную концентрацию дисульфид-стабилизированных белков. Добавьте буфер для проб без восстановления и нагрейте образец.

Этот буфер содержит SDS, который придает белкам общий отрицательный заряд, и отслеживающий краситель для визуализации их движения в геле. В буфере отсутствует какой-либо восстановитель, что позволяет дисульфидным связям оставаться неповрежденными, способствуя сохранению мультимерного комплекса в целости.

Загрузите отдельные комплексы в лунки полиакриламидного геля нужного процентного соотношения, предварительно собранного в гелевом аппарате. Добавьте в другую лунку белковую лестницу известного размера. Погрузите скважины в работающий буфер на основе SDS и подключите аппарат к источнику питания.

Электрический ток заставляет отрицательно заряженные белковые комплексы двигаться через поры геля к аноду - положительному выводу. Поскольку белковые комплексы равномерно отрицательно заряжены, разделение происходит в зависимости от размера, где мультимеры образуют заметную полосу с более высокой молекулярной массой в определенном положении.

Сравните размер отделенной белковой полосы с лестницей. Отсутствие в геле полос с более низкой молекулярной массой подтверждает успешное разделение интактных мультимерных комплексов.

Приготовьте 1 литр 1X Трис-глицина бегового буфера, смешав 25 миллимоляров Триса, 192 миллимолярных глицина и 0,1% от массы на объем SDS. Затем настройте рабочее устройство SDS-PAGE.

Откройте упаковку TGX SDS-PAGE с содержанием 16% литого материала в соответствии с протоколом производителя и извлеките кассету. Снимите гребень, которым выстланы лунки, и ленту со дна кассеты, и поместите гель в беговой аппарат. Заполните камеру работающим буфером 1X, пока лунки не будут погружены в жидкость.

С помощью пластиковой пипетки промойте лунки с работающим буфером. Загрузите образцы в гель вместе с 10 микролитрами предварительно окрашенного стандартного маркера. Наконец, запустите гель при напряжении 200 вольт, пока фронт красителя не окажется примерно в 1 сантиметре от дна геля.