Двумерный электрофорез в полиакриламидном геле: метод разделения для анализа белков в сложной белковой смеси на основе заряда и молекулярной массы

Для двумерного гель-электрофореза белковой смеси, полученной из гомогенизированной опухолевой ткани, обрабатывают буфером, содержащим хаотропы, цвиттерионное детергент и восстановитель. Хаотропы и моющие средства денатурируют и растворяют белки. Восстановители уменьшают дисульфидные связи белков, генерируя свободные тиоловые группы и разворачивая белки для оптимального разрешения белка.

Переложите обработанную белковую смесь в иммобилизованный держатель для градиента pH, IPG, стрип. Поместите полоску IPG, содержащую линейный градиент pH, внутрь матрицы акриламидного геля. Добавьте минеральное масло для предотвращения испарения белкового раствора. Перевести держатель в изоэлектрическую фокусировку, систему ИЭФ. Дайте белковому раствору регидратировать полоску.

Выполнение IEF первого измерения. Электрический ток заставляет заряженные белки мигрировать через градиент pH к противоположно заряженным электродам, обездвиживая их соответствующие изоэлектрические точки - pH, при которых белки имеют нулевой суммарный заряд.

После ИЭФ обработайте полоску IPG додецилсульфатом натрия, SDS, анионным моющим средством, которое придает отрицательный заряд белкам. Уравновешивайте с помощью алкилирующего агента для модификации белковых тиоловых групп, обеспечивая растворимость белка во время электрофореза.

Наденьте полоску на сборный мелкопористый полиакриламид-гель и закрепите расплавленным агарозом. Заполните камеры содержащим SDS буфером для электрофореза. Инициируйте электрофорез второго измерения, перпендикулярно ИЭФ.

Отрицательно заряженные, более крупные молекулярные белки медленно движутся через гель к положительно заряженному аноду, чем более мелкие белки, облегчая разделение по размеру.

Окрасьте гель. Белки можно визуализировать в виде дискретных пятен на геле.

Чтобы начать эту процедуру, добавьте по 250 микролитров заранее приготовленного раствора образца белка в каждую щель 13-сантиметрового держателя полоски IPG. Поместите 18-сантиметровую полоску IPG гелеобразной стороной вниз на каждый раствор образца белка, стараясь избежать образования пузырьков. Затем добавьте от 3 до 4 миллилитров минерального масла, чтобы покрыть каждую полоску IPG.

Затем соберите каждый держатель ленты IPG в изоэлектрическую систему фокусировки, заостренный конец которой находится на задней пластине, а квадратный конец — на передней пластине. После регидратации полосок IPG в течение 18 часов при комнатной температуре установите параметры IEF на изоэлектрической системе фокусировки с общим временем работы 7,5 часов и 36 875 вольт-часов.

После IEF выньте каждую полоску IPG из изоэлектрической системы фокусировки, а излишки минерального масла удалите нерастворимым бумажным полотенцем. Затем заверните каждую полоску в лист полиэтиленовой пленки и храните при температуре -80 градусов по Цельсию.

Чтобы отлить 12% гель PAGE, добавьте в стакан воду двойной дистилляции, 1,5 моляра трисоляного буфера, 40% исходный раствор акриламида/бисакриламида, 10% персульфат аммония и TEMED. Аккуратно перемешайте раствор геля, стараясь не допустить образования пузырьков.

Аккуратно влейте раствор геля в камеру для многоразливки, до предполагаемой высоты геля 19 сантиметров. Немедленно добавьте около 3 миллилитров дважды дистиллированной воды в камеру мультилитья, чтобы покрыть каждый разрешающий гель, и дайте каждому гелю полимеризоваться в течение примерно одного часа.

Этот шаг очень важен для приготовления качественного геля SDS-PAGE. На верх каждого геля необходимо сразу добавить равный объем воды.

Приготовьте два литра буфера для электрофореза, затем добавьте буфер в буферный бак блока разделения электрофореза.

После извлечения сфокусированных полосок IPG из морозильной камеры поместите их в пластиковый сосуд, содержащий 1 миллилитр буфера восстановительного равновесия и след бромфенольного синего, и уравновесьте их в течение 10 минут с легким покачиванием. После удаления буфера восстановительного равновесия добавьте 4 миллилитра буфера алкилирования равновесия и след бромфенольного синего в полоски IPG и уравновесьте их в течение 10 минут с легким покачиванием.

Во время равновесия геля разберите камеру мультилитья и снимите подготовленную фильтрующую гелевую кассету. Трижды промойте гелевую кассету водой двойной дистилляции, затем удалите лишнюю воду из гелевой кассеты нерастворимым бумажным полотенцем и поместите ее в гелевую подставку.

После этого промойте уравновешенные полоски IPG с помощью буфера для электрофореза и удалите излишки жидкости с каждой поверхности полоски IPG нерастворимым бумажным полотенцем. Поместите полоску IPG на разрешающий гель SDS-PAGE, позволив пластиковой стороне полоски IPG соприкасаться с более длинной стеклянной пластиной заостренным концом влево.

Теперь быстро добавьте от 3 до 4 миллилитров горячей 1% агарозы и буфера для электрофореза SDS, чтобы запечатать полоску IPG на верхней части каждого геля SDS-PAGE, и поместите верхнюю сторону полоски IPG вниз на верхнюю часть более короткой стеклянной пластины, стараясь избежать образования пузырей.

Эти шаги очень важны для запечатывания ленты IPG с гелем SDS-PAGE. Горячие растворы агарозы должны быть немедленно добавлены, а полоска IPG должна быть немедленно помещена в верхнюю часть геля SDS.

После полимеризации вставляют собранную гелевую кассету вертикально между пластиковыми прокладками и вертикальной системой электрофореза. Поместите верхнюю часть геля с полоской IPG рядом с катодом. Далее отрегулируйте уровень буфера для электрофореза, чтобы погрузить гелевую кассету, добавив соответствующий объем буфера в систему электрофореза.

Подключите и переведите блок питания в режим постоянного напряжения и работайте при напряжении 200 вольт около 370 минут, контролируя краситель. После завершения прогона извлеките гелевую кассету из системы электрофореза и аккуратно извлеките гель из гелевой кассеты, стараясь не порвать гель.