Зимографический гель-электрофорез: электрофоретический метод обнаружения матриксных металлопротеиназ путем оценки ферментативной активности

Матриксная металлопротеиназа, или ММП, многодоменная протеаза, содержащая пропептид и каталитические домены, секретируется в виде неактивного фермента или зимогена определенными клетками. Взаимодействие между каталитическим доменом ионом цинка и остатком цистеина пропептидного домена делает ММП неактивным.

Для обнаружения ММП в надосадочной жидкости клеточных культур методом зимографического гель-электрофореза необходимо заполнить емкость электрофореза, содержащую гелевую кассету, додецилсульфатом натрия или содержащим SDS-содержащим проточным буфером.

Загрузите надосадочную жидкость культуры, смешанную с загрузочным буфером, а затем с белковыми стандартами, в лунки полиакриламидного геля, сополимеризованного с белковым субстратом, специфичным для ММП.

SDS, отрицательно заряженное моющее средство, в невосстановительных условиях нарушает цистеин-цинковые взаимодействия в MMP и денатурирует белки, придавая при этом отрицательный заряд.

Провести электрофорез. Электрическое поле заставляет отрицательно заряженные белки мигрировать к положительно заряженному аноду, вызывая разделение белков в зависимости от размера.

После электрофореза обработайте гель неионогенным моющим буфером, содержащим ренатурирующий буфер. Неионогенные детергенты заменяют SDS, ренатурируя белки и частично восстанавливая активность MMP. В дальнейшем MMP обрабатываются до полностью активного состояния.

Инкубируйте в развивающемся буфере, содержащем катионы двухвалентных металлов, необходимые для активности MMP. Активные ММП вместе с катионами расщепляют субстрат ММП в геле. Смойте гель, чтобы удалить переваренные продукты. Окрасьте гель.

Участки активности ММП, лишенные субстрата ММП, проявляются в виде четких полос на темно-синем фоне непереваренного субстрата. С помощью подходящего программного обеспечения интенсивность гелеобразной ленты может быть коррелирована с активностью MMP.

Перед началом применения этого протокола необходимо подготовить все матриксные металлопротеиназы (ММП) в достаточном объеме для поддержания функции ферментов. Образцы можно использовать сразу или хранить при температуре -80 градусов Цельсия. Здесь ММП-2, также известная как желатиназа А или коллагеназа IV типа, используется для демонстрации визуализации активности ММП с помощью зимографии.

После того, как ферменты MMP были приготовлены, приобретите мешочек с гелем для 10% желатиновой зимограммы, содержащий гель внутри кассеты. Промойте кассету деионизированной водой. Снимите защитную ленту с нижней части кассеты, а расческу с верхней части геля. Трижды промойте лунки с помощью проточного буфера Tris-Glycine SDS.

Поместите гель в аппарат для электрофореза с мини-ячейками, следя за тем, чтобы меньшая сторона кассеты была обращена внутрь. Зафиксируйте гель на месте с помощью гелевого натяжного клина. Заполните верхнюю камеру аппарата проточным буфером Tris-Glycine SDS над уровнем лунок и проверьте наличие утечек. Нижнюю камеру установки для гель-электрофореза также заполните рабочим буфером.

Затем загрузите 10 микролитров белкового молекулярного маркера.

Смешайте равное количество образца с буфером для загрузки геля, который не содержит восстановителей. В отличие от обычного SDS-PAGE, образцы не кипятят, а загружают их непосредственно в лунки геля, используя наконечники для загрузки геля. Эти лунки могут вмещать до 20 микролитров объема.

Наденьте крышку на мини-ячейку, и подключите электродные шнуры к источнику питания. Включите источник питания и установите гель на постоянное напряжение 125 вольт в течение 90 минут. Проверьте образование мелких пузырьков на проводе нижней камеры, свидетельствующих о циркуляции тока.

При запуске первого геля каждые 15 минут следите за ходом миграции, используя в качестве индикатора бромфеноловый синий, входящий в состав буфера загрузки. Для каждого геля приготовьте 100 миллилитров буфера для ренатурации 1X и 200 миллилитров буфера для проявки зимограммы, оба в деионизированной воде.

Когда бромофеноловый синий трекинговый краситель достигнет дна геля, выключите источник питания.

Откройте мини-ячейку, и удалите гель. Разделите две стороны кассеты с помощью гелевого ножа. Отрежьте уголок, чтобы отметить направление геля. Осторожно достаньте гель из кассеты, и поместите его в емкость со 100 миллилитрами ренатурирующего буфера.

Выдержать гель в течение 30 минут при комнатной температуре при слабом перемешивании.

Снимите ренатурирующий буфер и добавьте в гель 100 миллилитров проявляющего буфера. Выдерживать 30 минут при комнатной температуре при слабом перемешивании.

Затем удалите проявляющий буфер и добавьте в гель еще 100 миллилитров свежего проявляющего буфера. Инкубируйте гель в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия.

После ночной инкубации удалите проявляющийся буфер и промойте гель, инкубируя его деионизированной водой, при слабом перемешивании, в течение 5 минут при комнатной температуре. Повторите эту стирку два раза.

Поместите гель на защитный слой из пластиковой пленки и удалите пузырьки. Затем отсканируйте гель с помощью фотосканера, чтобы сохранить точное расположение стандартных полос белка, так как после окрашивания гелем они станут едва заметными.

Испачкайте гель, добавив в гель 20 миллилитров SimplyBlue SafeStain. Выдержать гель в течение 1 часа при комнатной температуре, при слабом перемешивании.

Удалите пятно SimplyBlue SafeStain и удалите пятно в 100 миллилитрах деионизированной воды комнатной температуры при легком перемешивании.

Через 1 час замените на свежую деионизированную воду, и продолжайте инкубировать гель не менее одного часа.