Зимографический гель-электрофорез: электрофоретический метод обнаружения матриксных металлопротеиназ путем оценки ферментативной активности

Матриксная металлопротеиназа, или ММП, многодоменная протеаза, содержащая пропептид и каталитические домены, секретируется в виде неактивного фермента или зимогена определенными клетками. Взаимодействие между каталитическим доменом ионом цинка и остатком цистеина пропептидного домена делает ММП неактивным.

Для обнаружения ММП в надосадочной жидкости клеточных культур методом зимографического гель-электрофореза необходимо заполнить емкость электрофореза, содержащую гелевую кассету, додецилсульфатом натрия или содержащим SDS-содержащим проточным буфером.

Загрузите надосадочную жидкость культуры, смешанную с загрузочным буфером, а затем с белковыми стандартами, в лунки полиакриламидного геля, сополимеризованного с белковым субстратом, специфичным для ММП.

SDS, отрицательно заряженное моющее средство, в невосстановительных условиях нарушает цистеин-цинковые взаимодействия в MMP и денатурирует белки, придавая при этом отрицательный заряд.

Провести электрофорез. Электрическое поле заставляет отрицательно заряженные белки мигрировать к положительно заряженному аноду, вызывая разделение белков в зависимости от размера.

После электрофореза обработайте гель неионогенным моющим буфером, содер