Анализ активности фосфолипазы: анализ диффузии геля для определения активности фосфолипазы в экстракте сырого яда из Anthopleura dowii

Фосфолипиды – это комплексные липиды, содержащие фосфатные группы. Эти молекулы гидролизуются ферментом под названием фосфолипаза.

Для проведения анализа на активность фосфолипазы берут эмульсию яичного желтка, богатую фосфолипидами, которые выступают в качестве субстрата для фермента. Добавьте желток в теплый раствор агарозы, содержащий хлорид натрия, который усиливает стабильность белков желтка во время последующих этапов.

Дополните смесь хлоридом кальция и флуоресцентным красителем – родамином. Вылейте смесь в тарелку Петри. После затвердевания фосфолипиды желтка остаются равномерно распределенными в матрице агарозного геля.

С помощью трубки создайте в геле лунки на соответствующем расстоянии. Добавьте в лунки экстракт сырого белка, содержащий фосфолипазу, в различных концентрациях. Инкубируйте тарелку при физиологической температуре.

Фосфолипаза из экстракта диффундирует радиально в гель. Ионы кальция в геле связываются с фосфолипазой, активируя ферменты. Этот фермент расщепляет фосфолипиды, образуя свободные жирные кислоты. Молекулы родамина в геле образуют комплекс с высвобождающимися жирными кислотами.

При освещении ультрафиолетовым светом наблюдайте появление флуоресцентных ореолов вокруг лунок. Ореол подтверждает наличие активности фермента. При более высоких концентрациях фосфолипазы молекулы фермента диффундируют дальше, увеличивая диаметр ореола.

Вымойте одно куриное яйцо с 1% SDS в дистиллированной воде и отделите яичный желток от яичного белка в стерильных условиях.

Приготовьте растворы А, В, В и D. Добавьте по 500 микролитров растворов А и С в раствор В, и по 100 микролитров раствора D. Смешайте их и налейте по 25 миллилитров в каждую чашку Петри. Подождите, пока раствор застынет в стерильных условиях, и сделайте лунки диаметром примерно от 2 до 3 миллиметров с помощью тонкой трубки.

Добавьте в общей сложности 20 микролитров фосфатного буфера в качестве отрицательного контроля в одну лунку и 20 микролитров определенной фосфолипазы в качестве положительного контроля в другой лунке.

Поместите разное количество сырого белка экстракта - 5, 15, 25, 35 и 45 микрограмм в остальные лунки, каждая в конечном объеме 20 микролитров. Выдерживать при температуре 37 градусов Цельсия в течение 20 часов.