Анализ хиральности клеток с кольцевым микропаттернированием: метод in vitro для определения многоклеточной хиральности на основе выравнивания клеток на кольцеобразных микропаттернах

Чтобы определить хиральность клеток млекопитающих in vitro - смещение клеток влево и вправо в ориентации влево или вправо в ограничивающих условиях - начните с изготовленных на заказ предметных стекол с золотым покрытием в многолуночном планшете, содержащем среду. Слайды содержат микроузоры кольцеобразных островков фибронектина, способствующего клеточной адгезии, заполненных самоорганизующимся монослоем, устойчивым к клеточной адгезии.

Затем засейте соответствующий объем суспензии клеток млекопитающих на предметные стекла и инкубируйте. Клетки адсорбируются на микропаттернах фибронектин-содержащего кольца. Окружающий самоорганизующийся монослой предотвращает прикрепление неспецифических клеток за пределами кольцевых границ.

Замените носитель, удалив все неприкрепленные элементы, на свежий носитель. Добавьте в один набор предметных стекол препарат, интерферирующий актин, и инкубируйте.

Адгезивные клетки пролиферируют, распространяются и принимают форму нижележащих фибронектиновых островков, реорганизуя свои актиновые волокна в ответ на пространственные сигналы, которые ограничивают монослой клетки, способствуя смещенному выравниванию.

Теперь обработайте предметные стекла параформальдегидом для фиксации клеток. При фазово-контрастной микроскопии клетки на кольцевых микроузорах выглядят как темные области с яркими контурами, выровненными в соответствии с их предпочтительным смещением.

С помощью программного обеспечения рассчитайте угол выравнивания каждой ячейки как отклонение от направления окружности кольца. Среднее значение для определения хиральности клеток млекопитающих. Актин-интерферирующие клетки, обработанные лекарственными препаратами, могут проявлять обратную хиральность.

Перед тем как засеять клетки, прогрейте среду и трипсин на водяной бане, закаленной при 37 градусах Цельсия.

Для лучшего прикрепления клеток замочите предметное стекло в 12-луночной пластине, содержащей питательную среду, и нагрейте ее при температуре 37 градусов Цельсия в инкубаторе. После того, как клетки будут трипсинизированы, нейтрализуйте клетки с помощью FBS-содержащей среды. Гранулируйте клетки в концентрации 100 x g в течение 3 минут, а затем повторно суспендируйте клеточную гранулу в свежей среде. Подсчитайте клетки и разбавьте клеточную суспензию до достижения концентрации 200 000 клеток на миллилитр.

Добавьте 0,5 миллилитра клеточной суспензии в каждую лунку, содержащую одно золотое стекло. Осторожно встряхните планшет несколько раз для равномерного посева клеток, перед инкубацией в течение 15 минут для прикрепления клеток. Через 15 минут проверьте прикрепление клетки под микроскопом и, при необходимости, инкубируйте еще некоторое время.

После того, как клетки присоединены, отсасывайте среду, содержащую неприкрепленные клетки, из каждой лунки и добавьте 1 миллилитр свежей питательной среды. Культивируйте клетки в инкубаторе в течение 24 часов и проверьте слияние, чтобы определить, сформировалась ли хиральность.

Когда необходимая конфлюенция будет достигнута, зафиксируйте клетки, удалив питательные среды. После однократного промывки PBS добавьте в предметное стекло 4% раствор параформальдегида и выдерживайте при комнатной температуре в течение 15 минут, перед тем как снова промыть PBS три раза.

Для получения изображений используйте фазово-контрастный микроскоп с функцией камеры и захватывайте каждое кольцо на предметном стекле с высоким разрешением.

Для определения характеристик хиральности загрузите файлы кода MATLAB. Добавьте папку с кодом и подпапки в путь MATLAB и откройте файл "ROI_selection.m". В строке 4 измените директорию на нужную папку с данными.

Измените размер изображения в строке 14, где первые две цифры представляют размер внутреннего круга кольца, а две другие представляют внешний.

Чтобы определить область интереса или ROI на фазово-контрастных изображениях, выполните код MATLAB "ROI_selection.m" m, нажав кнопку "Выполнить". Вручную перетащите выделенный квадрат по размеру кольца, затем дважды щелкните по изображению, чтобы подтвердить выбор.

После выбора ROI из всех изображений в папке будет сгенерирован файл ".mat" для хранения информации о ROI для каждого изображения. Затем откройте файл "Analysis_batch.m" и измените каталог папки, как показано ранее. Нажмите на кнопку «Выполнить», чтобы выполнить код «Analysis_batch.m» для определения хиральности нескольких паттернов клеточного кольца.

Будет сгенерирован файл "datatoexcel.txt", содержащий круговую статистику для каждого кольца, а также количество колец по часовой стрелке, без хиральной стрелки и против часовой стрелки.