Анализ поглощения внеклеточных везикул: метод визуализации и количественной оценки клеточного поглощения внеклеточных везикул с использованием метода 3D-флуоресцентной визуализации

Для облегчения клеточной коммуникации клетки выделяют внеклеточные везикулы, ВВ – наноразмерные структуры, окруженные липидной мембраной. Электромобили перевозят различные биологические грузы, в том числе макромолекулы и метаболиты, для доставки их к клеткам-реципиентам.

Чтобы визуализировать поглощение ВВ клетками с помощью конфокальной микроскопии, сначала возьмите свежевыделенные ВВ. Эти EV предварительно помечены антителами, связанными с флуоресцентным зондом для последующей легкой визуализации.

Добавьте достаточное количество меченных флуоресцентно меченных ВВ в адгезивную культуру клеток-реципиентов. Высиживайте в течение нужного срока. Во время инкубации субпопуляция меченых ВВ поверхностно прикрепляется к поверхности клетки, в то время как другие ВВ усваиваются.

Добавьте другой флуоресцентный краситель для маркировки цитоплазмы клетки, помогая отличить интернализованные ВВ от тех, которые прилипли к клетке-реципиенту. Поместите ячейки под конфокальный микроскоп и получите изображение в разных фокальных плоскостях вдоль оси z, получая серию оптических сечений по всей толщине образца.

Скомпилируйте эту коллекцию оптических сечений - z-стек - для формирования трехмерного изображения с высоким разрешением. Примените виртуальный рендеринг - процесс поствизуализации - для реконструкции поверхностей клеток.

Чтобы отличить внешне прилипшие электромобили от интернализованных, визуализируйте их в виде точек разных оттенков. Рассчитайте объем ячеек и количество интернализованных ими электромобилей, количественно оценив поглощение электромобилей на ячейку.

Высадите 4 x 10 4 ячейки PC3 в 35-миллилитровую посуду с 1-миллилитровой средой. Дайте клеткам прилипнуть в течение ночи в оптимальных условиях клеточной культуры. На следующий день дважды промойте прилипшие клетки средой, обедненной экзосомами.

После разбавления меченых флуоресцентно меченных ВВ до соответствующей концентрации с использованием среды, обедненной экзосомами, добавьте разведенные ВВ к прикрепленным клеткам-мишеням и инкубируйте в течение желаемого экспериментального времени. После удаления неинтернализованных ВВ путем трижды промывки клеток средой, не содержащей экзосом, пометить цитоплазму прикрепленных клеток 1 мкг/мл CMTMR и инкубировать в оптимальных условиях клеточной культуры.

Для визуализации живых клеток поместите подготовленные клетки в инкубатор на сцене. После установки параметров визуализации на основе контрольных образцов определите глубину залегания целевых клеток и диапазон размера укладки в направлении z для получения 3D-конфокальных изображений. Затем настройте получение изображения на несколько z-стекированных изображений как клеточного, специфичного красителя, так и EV-специфичного красителя одновременно.

Для обработки изображений используйте программное обеспечение для автоматической обработки изображений.

Чтобы построить виртуальные поверхности ячеек, нажмите на кнопку «Добавить новые поверхности». Чтобы настроить виртуальные поверхности ячеек, нажмите кнопку «+ Добавить» и выберите «Качество» в качестве «Типа фильтра». Установите пороговое значение для нижнего предела путем визуального осмотра, установите максимальное значение для верхнего предела и нажмите кнопку «Готово».

Далее, чтобы построить виртуальные точки электромобилей, нажмите кнопку «Добавить новые точки». В разделе «Настройки алгоритма» выберите «Различные размеры пятна» и «Расчет кратчайшего расстояния». Затем нажмите «Далее» и выберите «Канал 1 - Alexa Fluor 488» в качестве «Исходного канала». Введите соответствующее значение для «Расчетного диаметра XY» в разделе «Обнаружение пятна» и нажмите «Далее».

Чтобы настроить виртуальные точки EV, нажмите кнопку «+ Добавить» и выберите «Качество» в качестве «Типа фильтра». Установите «Нижний порог» при визуальном осмотре и нажмите «Далее». Для параметра «Тип точечных областей» выберите «Абсолютная интенсивность», затем нажмите «Далее».

Чтобы определить пороговое значение области точек EV, введите соответствующее значение для параметра «Порог региона» при визуальном осмотре. Выберите «Диаметр от» в разделе «Региональный объем» и нажмите «Готово».

Чтобы разделить сгруппированные пятна внутри построенной поверхности, нажмите на созданные «Пятна» и перейдите в «Фильтры». Затем нажмите кнопку «Добавить» и выберите «Кратчайшее расстояние до поверхностей Surfaces = Surface 1» в качестве «Типа фильтра».

Установив нижний порог для нижнего предела и соответствующее значение для верхнего предела, нажмите кнопку «Дублировать раздел на новые места».

Для автоматического подсчета EV внутри ячеек нажмите на построенный «Выбор точек 1», перейдите в «Статистику» и экспортируйте значение из «Общего количества мест».

Чтобы получить количество ячеек, нажмите на построенную «Поверхности 1», затем перейдите в «Статистику» и экспортируйте значение «Общее количество поверхностей» из «Всего». Наконец, перейдите на вкладку «Подробно» в разделе «Статистика», чтобы экспортировать объем.