Энциклопедия экспериментов JoVE
Биологические методы
0 просмотров • 3:44 мин. • July 8th, 2025
В митохондриях цитратсинтаза, локализованная в матриксе внутренней митохондриальной мембраны, является ферментом, ограничивающим скорость, который катализирует реакцию между ацетилкоэнзимом А и щавелоуксусной кислотой с образованием цитрата, первого этапа цикла лимонной кислоты.
Чтобы проанализировать активность цитратсинтазы, перенесите грудную клетку мухи дрозофилы в изобилии в митохондриях в трубку, заполненную охлажденным экстракционным буфером, содержащим этилендиаминтетрауксусную кислоту, ЭДТА и неионогенный детергент.
Гомогенизируйте ткани грудной клетки на льду, чтобы предотвратить теплоопосредованную денатурацию белков. Приложенная сила сдвига в сочетании с моющими средствами лизирует ткань и высвобождает внутриклеточные компоненты, включая митохондрии.
Далее разрыв внутренней митохондриальной мембраны приводит к высвобождению белков митохондриального матрикса, в том числе цитратсинтазы. ЭДТА связывается с двухвалентными катионами и подавляет активность протеазы, тем самым предотвращая деградацию белка.
Разбавьте гомогенат с помощью экстракционного буфера и добавьте соответствующий объем в реакционную смесь, содержащую лунки многолуночного планшета. Реакционная смесь содержит ацетилкоэнзим А, щавелоуксусную кислоту и дитионитробензойную кислоту.
Цитратсинтаза в гомогенате катализирует реакцию между щавелоуксусной кислотой и ацетилкоэнзимом А, образуя цитрат и коэнзим А с тиоловой группой. Тиоловая группа вступает в реакцию с бесцветной дитионитробензойной кислотой, образуя желтый продукт – тионитробензойную кислоту.
С помощью считывателя микропланшетов измерьте поглощение раствора желтого цвета. Абсорбция может быть связана с активностью цитратсинтазы в тканевом гомогенате.
Немедленно перенесите 10 взрослых грудных клеток мух в 100 микролитров ледяного буфера для экстракции и гомогенизируйте их пестиком на льду. Держите образцы в холоде, гомогенизируя их в течение 5-10 секунд на льду, оставляя их на льду в течение пяти секунд, затем повторяйте до тех пор, пока все ткани не будут полностью гомогенизированы.
Квотируйте 10 микролитров каждого гомогенизированного образца в новую пробирку для измерения содержания белка, сохраняя эти пробирки также на льду. Добавьте 400 микролитров ледяного буфера для экстракции в каждый оставшийся образец общим объемом 500 микролитров и осторожно перемешайте пипеткой вверх и вниз.
Для каждой реакции добавляйте 1 микролитр разведенного клеточного лизата на 150 микролитров свежеприготовленного реакционного раствора. Тщательно перемешайте с помощью аккуратного пипетирования, стараясь не допускать образования пузырьков. Затем с помощью планшетного считывателя измеряйте поглощение на 412 нанометрах каждые 10–30 секунд в течение четырех минут при температуре 25 градусов Цельсия.
Отобразите данные в виде поглощения с течением времени, а затем рассчитайте наклон для линейной части кривой. Наконец, разделите скорость реакции или наклон на концентрацию белка образца, чтобы нормализовать активность цитратсинтазы.