Анализ активности цитратсинтазы: колориметрический анализ для измерения активности митохондриальной цитратсинтазы в гомогенате тканей дрозофилы

В митохондриях цитратсинтаза, локализованная в матриксе внутренней митохондриальной мембраны, является ферментом, ограничивающим скорость, который катализирует реакцию между ацетилкоэнзимом А и щавелоуксусной кислотой с образованием цитрата, первого этапа цикла лимонной кислоты.

Чтобы проанализировать активность цитратсинтазы, перенесите грудную клетку мухи дрозофилы в изобилии в митохондриях в трубку, заполненную охлажденным экстракционным буфером, содержащим этилендиаминтетрауксусную кислоту, ЭДТА и неионогенный детергент.

Гомогенизируйте ткани грудной клетки на льду, чтобы предотвратить теплоопосредованную денатурацию белков. Приложенная сила сдвига в сочетании с моющими средствами лизирует ткань и высвобождает внутриклеточные компоненты, включая митохондрии.

Далее разрыв внутренней митохондриальной мембраны приводит к высвобождению белков митохондриального матрикса, в том числе цитратсинтазы. ЭДТА связывается с двухвалентными катионами и подавляет активность протеазы, тем самым предотвращая деградацию белка.

Разбавьте гомогенат с помощью экстракционного буфера и добавьте соответствующий объем в реакционную смесь, содержащую лунки многолуночного планшета. Реакционная смесь содер