JoVE Encyclopedia of Experiments
Биологические методы
0 просмотров • 3:03 мин • July 8th, 2025
В тканях железо, важный минерал, критически важный для различных метаболических процессов, обычно присутствует в секвестрированном до гемопротеинов и негемовых белков железа. Гемопротеины включают двухвалентное или гемовое железо, связанное с порфириновыми кольцами, в то время как негемовые белки железа не имеют структуры порфиринового кольца и в основном состоят из трехвалентного или негемового железа.
Чтобы оценить содержание негемового железа в ткани печени мыши, обработайте высушенный, собранный фрагмент ткани печени мыши низкими концентрациями соляной кислоты и трихлоруксусной кислоты. Инкубируйте при высоких температурах, чтобы переварить ткань и способствовать выпадению белка, вызванного кислотой.
Благодаря низким концентрациям кислот негемовое железо высвобождается из связанных с ним белков. Гемовое железо, будучи связанным с порфириновым кольцом, остается незатронутым.
После охлаждения переложите нужный объем надосадочной жидкости, содержащей негемовое железо, в многолуночную пластину. Добавьте в подходящий буфер хромогенный хелатор железа, сульфонат батофенантропината, BPS, дополненный тиогликолевой кислотой, восстановителем и инкубируйте.
Тиогликолевая кислота восстанавливает все трехвалентное негемовое железо до двухвалентного железа, которое может легко связываться с BPS в соотношении 1:3, образуя высокостабильный комплекс розового цвета. Кроме того, тиогликолевая кислота предотвращает помехи из-за любых загрязняющих катионов двухвалентных металлов, таких как медь, которые могут взаимодействовать с BPS.
Поместите многолуночный планшет в считыватель микропланшетов для измерения абсорбции розовых комплексов железа-BPS, представляющих концентрацию негемового железа в фрагменте ткани печени мыши.
Переложите каждый высушенный кусочек ткани в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра. Добавьте в тюбик 1 миллилитр кислотной смеси, и закройте ее. Приготовьте заготовку с кислотой таким же образом, за исключением того, что ткань здесь опущена.
Инкубируйте пробирки при температуре 65 градусов Цельсия в течение 20 часов, чтобы переварить ткань.
После охлаждения до комнатной температуры с помощью микропипетки с пластиковыми наконечниками переведите 500 микролитров экстракта прозрачной кислоты в новую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитров
.Готовьте реакции хромогена непосредственно в плоскодонных, 96-луночных, прозрачных, необработанных, полистирольных микропланшетах. Выдерживать при комнатной температуре в течение 15 минут.
Измерьте поглощение образца в планшетном считывателе на длине волны 535 нанометров относительно эталона деионизированной воды.