Анализ с вытягиванием одной молекулы для анализа фосфорилирования белков: высокопроизводительный метод для количественной оценки фосфорилирования белка в клеточном лизате

Фосфорилирование определенных клеточных белков важно для их биологической функции.

Чтобы количественно оценить уровни фосфорилирования интактных белков с помощью анализа с использованием одной молекулы, начните со снятия стеклянной покровной пленки с сетчатым рисунком. Каждый отсек покрыт биотинилированным полиэтиленгликолем или линкерами на основе ПЭГ, чередующимися с нормальным ПЭГ, для предотвращения стерического препятствия во время связывания белка.

Обработайте покровное стекло восстановительным реагентом, чтобы свести к минимуму автофлуоресценцию при анализе. Наложите на покровное стекло нейтравидины - биотин-связывающие белки - и инкубируйте, позволяя им связывать биотинилированные линкеры ПЭГ.

Дополните матрицу специфическими антителами к белку-мишени. Каждое антитело содержит биотин, связанный с его Fc-областью, который помогает закрепить антитело к нейтравидину, вызывая иммобилизацию.

Теперь добавьте лизат клеточной культуры, содержащий различные белки, в том числе фосфорилированные и нефосфорилированные варианты целевого белка с зеленой флуоресценцией, и инкубируйте. Оба варианта белка-мишени захватываются антителами, образуя комплексы. Промойте, чтобы удалить несвязанные белки.

Затем обработайте эти комплексы вторым набором красных флуоресцентно меченных антител, которые связывают исключительно фосфорилированные остатки белка, передавая комплексу другой флуоресцентный сигнал.

Визуализируйте решетку под флуоресцентным микроскопом и наблюдайте за двумя различными флуоресцентными сигналами. Колокализация обоих сигналов флуоресценции указывает на наличие фосфорилированных белков в образце.

Извлеките функционализированные массивы биотин-ПЭГ из морозильной камеры и уравновесьте их до комнатной температуры. Поместите покровное стекло матрицей вверх на 100-миллиметровую чашку для культуры тканей, выстланную герметизирующей пленкой. Инкубируйте каждый квадрат массива с 10 миллиграммами на миллилитр борогидрида натрия и PBS в течение 4 минут при комнатной температуре. Трижды вымыть с PBS.

Затем инкубируйте с 0,2 миллиграмма на миллилитр NeutrAvidin в Т50 в течение 5 минут, после чего трижды промывайте Т50-БСА. Повторите инкубацию с 2 мкг на миллилитр биотинилированного POI-специфического антитела в T50-BSA в течение 10 минут, после чего промойте.

Сначала разморозьте и смешайте лизат с помощью пипетирования. Разведите 1 микролитр лизата в 100 микролитрах ледяного T50-BSA/PPI. Инкубируйте лизат на массиве в течение 10 минут, после чего последует промывка. Приготовьте AF647-конъюгированное антитело к фосфотирозину в ледяном T50-BSA/PPI и инкубируйте на матрице в течение 1 часа.

Нанесите каплю масла на цель. Поместите наносетку на сцену для визуализации. Используя проходящий белый свет, ориентируйтесь на рисунок сетки. Получите серию из 20 изображений сетки. Убедитесь, что пиксели не перенасыщены, и сохраните ряд изображений как «Реперный».

Расфокусируйте наносетку, чтобы создать узор Airy. Получите серию из 20 изображений для калибровки усиления и сохраните изображение как «Усиление». Затем получите серию из 20 изображений для смещения камеры, заблокировав весь свет камеры, и сохраните изображение в качестве фона.

Чтобы получить изображения SiMPull, сначала очистите масляный объектив и нанесите дополнительное масло на объектив. Закрепите защитное стекло на предметном столике микроскопа. Получите изображения для каждого образца, сначала в дальнем красном канале, а затем в флуорофорах с более низкой длиной волны. Проверяйте уровень буфера каждые 30-45 минут и пополняйте его по мере необходимости.