Анализ с вытягиванием одной молекулы для анализа фосфорилирования белков: высокопроизводительный метод для количественной оценки фосфорилирования белка в клеточном лизате

Фосфорилирование определенных клеточных белков важно для их биологической функции.

Чтобы количественно оценить уровни фосфорилирования интактных белков с помощью анализа с использованием одной молекулы, начните со снятия стеклянной покровной пленки с сетчатым рисунком. Каждый отсек покрыт биотинилированным полиэтиленгликолем или линкерами на основе ПЭГ, чередующимися с нормальным ПЭГ, для предотвращения стерического препятствия во время связывания белка.

Обработайте покровное стекло восстановительным реагентом, чтобы свести к минимуму автофлуоресценцию при анализе. Наложите на покровное стекло нейтравидины - биотин-связывающие белки - и инкубируйте, позволяя им связывать биотинилированные линкеры ПЭГ.

Дополните матрицу специфическими антителами к белку-мишени. Каждое антитело содержит биотин, связанный с его Fc-областью, который помогает закрепить антитело к нейтравидину, вызывая иммобилизацию.

Теперь добавьте лизат клеточной культуры, содержащий различные белки, в том числе фосфорилированные и нефосфорилированные варианты целевого белка с зеленой флуоресценцией, и инкубируйте. Оба варианта белка-мишени захватываются антителами, образуя комплексы. Промойте, чтобы удалить несвязанны