JoVE Encyclopedia of Experiments
Биологические методы
0 просмотров • 4:25 мин • July 8th, 2025
В метаболически активных клетках углеродсодержащие субстраты окисляются с помощью ряда биохимических реакций для получения энергии и высвобождения углекислого газа в качестве побочного продукта.
Чтобы определить скорость окисления субстрата, начните с адгезивной культуры желаемых недифференцированных клеток. Дополните клетки в среде подходящим субстратом, содержащим четырнадцать радиоактивных углеродов в их основе, и инкубируйте.
Клетки потребляют субстрат и окисляют его, выделяя меченый углекислый газ, который диффундирует из клеток в окружающую среду.
Переведите эту среду в газоулавливающую сборку, содержащую хлорную кислоту, чтобы погасить реакцию. Эта трубка содержит фильтровальную бумагу, пропитанную гидроксидом натрия, установленную внутри крышки пробирки. Закройте крышку, и инкубируйте.
Во время инкубации углекислый газ, в газообразной форме, выделяется внутрь трубки. Гидроксид натрия поглощает меченый радиоактивными веществами углекислый газ, захватывая его в фильтровальную бумагу. Переложите эту фильтровальную бумагу во флакон со сцинтилляционным коктейлем и поместите его внутрь счетчика жидкого сцинтилляции.
Внутри счетчика радиоактивно меченый углерод подвергается радиоактивному распаду, испуская высокоэнергетические бета-частицы. Эти частицы поглощаются компонентами сцинтилляционного коктейля и излучают световые импульсы, которые рассчитываются сцинтилляционным счетчиком.
Количество обнаруженной радиоактивности коррелирует со скоростью окисления субстрата в клетках.
Промойте клетки в дополнительных лунках, дважды с помощью DPBS. Диссоциировать клетки с помощью 0,25% трипсина-ЭДТА. Ресуспендируйте 20 микролитров переваренных клеток в DPBS с 20 микролитрами акридинового апельсина и раствором красителя йодида пропидиума. Определите количество живых клеток с помощью автоматического счетчика клеток и запишите их количество.
Дважды промойте клетки в пробирных лунках DPBS. Добавьте 500 микролитров горячей среды в каждую лунку для анализа в предназначенном для RAM капюшоне для культуры тканей. После герметизации планшета парапленкой инкубируйте клетки в инкубаторе, предназначенном для оперативной памяти, при температуре 37 градусов Цельсия в течение четырех часов.
Во время инкубации разрежьте фильтровальную бумагу на круглые кусочки, немного превышающие площадь внутри крышки микроцентрифужной пробирки объемом 1,5 миллилитра, и плотно вставьте бумагу в крышку. Добавьте 200 микролитров 1 молярной хлорной кислоты в каждую трубку и 20 микролитров гидроксида натрия в фильтровальную бумагу, установленную внутри колпачка.
После инкубации клеток переложите по 400 микролитров питательной среды из каждой лунки в подготовленные пробирки, и сразу же закройте крышки. Оставьте пробирки в штативе для пробирок при комнатной температуре на 1 час.
Параллельно, во время инкубации, установите для каждой пробирки сцинтилляционный флакон, и наполните его 4 миллилитрами сцинтилляционной жидкости. Переложите каждый лист фильтровальной бумаги в сцинтилляционный флакон и выдерживайте при комнатной температуре в течение 30 минут.
Проведите тесты салфеток на вытяжке для культуры тканей, водяной бане, холодильнике, инкубаторе, раковине, земле и любой другой рабочей зоне на предмет потенциального загрязнения оперативной памятью. Поместите бумажные салфетки в сцинтилляционные флаконы со сцинтилляционной жидкостью.
Измерьте радиоактивность углерода-14 в сцинтилляционных флаконах с помощью сцинтилляционного счетчика и запишите результаты показаний. При необходимости провести дезактивацию рабочей среды в соответствии с рекомендациями по радиационной безопасности.