Анализ бислоя липидов со сферической опорой: метод наблюдения за сборкой септина на микросферах

Септины являются ключевыми белками цитоскелета, которые связываются с изогнутыми поверхностями плазматической мембраны.

Чтобы наблюдать за сборкой септина in vitro на микросферах, сначала возьмем суспензию микроскопических гранул кремнезема одинакового размера, действующих как твердая опора для образования бислоя. Вихревой удар этой суспензии должен разбить любые пучки валиков.

Дополняют его мелкими униламеллярными везикулами, внедорожники – сферическими пузырьками, окруженными одним липидным бислоем. Инкубируют при постоянном перемешивании, не допуская оседания микросфер.

Во время инкубации внешние полярные головные группы способствуют адсорбции внедорожников на поверхности гидрофильной микросферы. Это взаимодействие приводит к разрыву SUV с последующим слиянием липидов SUV с изогнутой поверхностью микросферы в виде непрерывного слоя, что приводит к образованию сферического поддерживаемого липидного бислоя, SLB.

Промойте, чтобы удалить излишки несвязанных липидов и повторно суспендировать в буфере для реакции. Перенесите сферическую суспензию SLB на небольшой участок поверхности, покрытой полиэтиленгликолем, чтобы предотвратить неспецифическую адсорбцию. Добавьте в камеру суспензию септина, меченную флуоресцентными лампами, и инкубируйте.

Септины образуют гетероолигомеры, которые распознают положительную кривизну сферических SLB, полимеризуясь с образованием филаментов. В конце концов, септиновые филаменты взаимодействуют друг с другом, что приводит к образованию структур более высокого порядка.

Наблюдайте SLB, покрытые септином, под флуоресцентным микроскопом высокого разрешения. Наличие флуоресценции указывает на чувствительное к кривизне отложение септина.

Во-первых, сделайте вихревой перевес в бутылке, содержащей микросферы кремнезема, в течение 15 секунд. Затем примите ванну с помощью ультразвука в течение одной минуты и снова сделайте вихрь в течение 15 секунд, чтобы разбить все скопления. Смешайте шарики с SLBB и 10 микролитрами 5-миллимолярных внедорожников в микроцентрифужной пробирке с низким уровнем адгезии.

Выдержите гранулированно-липидную смесь в течение часа при комнатной температуре, на шейкере для предотвращения осаждения. Тем временем разморозьте PEGylated покровную крышку, и приклейте к ней отрезанную 0,2-миллилитровую ПЦР-пробирку. После инкубации центрифугируйте шарики в течение 30 секунд в назначенной RCF.

После первого отжима удалите 50 микролитров надосадочной жидкости. Затем добавьте 200 микролитров PRB и перемешайте с помощью энергичного пипетирования. Для следующих раундов уберите 200 микролитров PRB, а после второго и третьего спина добавьте еще 200 микролитров, а после четвертого спина добавьте 220 микролитров PRB.

Если вы проводите соревновательный анализ с несколькими размерами гранул, подготовьте реакцию, смешав равные объемы гранул каждого размера и разбавив 29 микролитров этой смеси гранул 721 микролитром реакционного буфера. Затем добавьте в лунки 75 микролитров разведенных шариков и 25 микролитров разведенного в SSB белка и перемешайте.

При измерении септинов в стационарном состоянии инкубируйте смесь при комнатной температуре в течение одного часа, а затем получите изображение с помощью почти TIRF или конфокальной микроскопии.