JoVE Encyclopedia of Experiments
Биологические методы
0 просмотров • 4:08 мин • July 8th, 2025
Ангиогенез – это образование новых кровеносных сосудов из уже существующих кровеносных сосудов при развитии и патологических состояниях. Обширная коммуникация между эндотелиальными клетками, которые выстилают внутреннюю поверхность кровеносных сосудов, и окружающими перицитами - поддерживающими клетками на внешней стороне кровеносных сосудов - имеет решающее значение для ангиогенеза.
Для изучения ангиогенеза in vitro начинают с эндотелиальных клеток и покрытых перицитами микроносителей, суспендированных в растворе фибриногена – растворимого гликопротеина, выступающего в роли предшественника фибрина.
Теперь пипетку суспензии в культуральную тарелку, содержащую раствор тромбина – протеолитического фермента, и инкубируйте. Тромбин связывается с молекулой фибриногена, вызывая ее расщепление с образованием нерастворимых мономеров фибрина, образуя полимерный фибриновый гель. Этот этап обеспечивает встраивание гранул с ячеистым покрытием в фибриновый гель.
Затем поместите культуру фибробластов - клеток-предшественников соединительной ткани - поверх фибринового геля и инкубируйте для активации фибробластов.
Во время инкубации фибробласты выделяют важнейшие ангиогенные факторы роста, которые запускают активацию эндотелиальных клеток. В комбинации адгезивные перициты и эндотелиальные клетки выделяют сигнальные молекулы, которые способствуют прорастанию эндотелиальных клеток в фибриновом геле.
Эндотелиальные ростки выглядят как обернутые перицитами удлиненные клеточные выступы, изображающие раннюю стадию ангиогенеза.
Рассмотрите чашки с шариками, покрытыми микроносителями, под микроскопом при 20-кратном увеличении, чтобы подтвердить, что все шарики были в достаточной степени покрыты эндотелиальными клетками.
Перенесите планшеты в ламинарный проточный колпак и с помощью пипетки P1000 энергично отсасывайте и диспенсируйте покрытые гранулами растворы, чтобы отделить клетки от дна пластин, и перенесите надосадочную жидкость в отдельные пробирки.
Дайте бусинам осесть на дно трубочек в течение трех минут. Затем с помощью пипетки P1000 удалите как можно больше надосадочной жидкости, не нарушая скопления шариков. Восстановите бусины в одном миллилитре полной среды на тюбик и дайте бусинам отстояться в течение 30-60 секунд. Используйте пипетку P1000 для повторной аспирации надосадочной жидкости и промойте свободно плавающие эндотелиальные клетки из суспензии гранул свежей готовой средой еще два раза, как показано выше.
После третьей стирки суспендируйте бусины в 2,5 миллилитрах раствора фибриногена. Добавьте 13 микролитров раствора тромбина на лунку, в стеклянную нижнюю пластину на 24 лунки. Затем добавьте 0,5 миллилитра раствора шариков/фибриногена в каждую лунку, тщательно пипетируя шарики непосредственно в тромбин, и медленно пипетируйте вверх и вниз два-три раза, чтобы тщательно перемешать растворы.
Когда все лунки будут засеяны, дайте раствору тромбина-фибриногена предварительно свернуться в колпаке ламинарного потока в течение 30 минут при комнатной температуре. По окончании инкубации осторожно перенесите планшет в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия еще на 1,5-2 часа.
Когда гель полностью застынет, ресуспендируйте нормальные фибробласты легких человека в концентрации 2 х 10 4 клеток на миллилитр в полной среде и добавьте по одному миллилитру фибробластов в каждую лунку. Затем верните планшет в инкубатор для клеточных культур.