Энциклопедия экспериментов JoVE
Биологические методы
0 просмотров • 3:55 мин. • July 8th, 2025
Чтобы оценить потенциал исследуемого ларвицидного соединения, антагонист дофаминовых рецепторов, используя личиночный контактный анализ, начинает с живых личинок комаров на желаемой стадии развития или стадии развития в водных средах. Перенесите равное количество личинок в лунки многолуночной пластины.
Замените фильтрующий материал в колодцах деионизированной водой, чтобы предотвратить любые помехи от загрязняющих веществ, которые могут негативно повлиять на личинок. Добавьте в соответствующие лунки возрастающие концентрации исследуемого состава.
Осторожно поворачивайте пластину, чтобы облегчить контакт между личинками и испытуемым составом. Инкубируйте тарелку в соответствующих условиях.
При контакте с личинками испытуемое соединение проникает в стенку тела или внешний слой и достигает дыхальцев – отверстий трахейной системы, которые соединены с ганглиями – скоплением нервных клеток, составляющими центральную нервную систему.
На нервных клетках тестируемое соединение связывается с вторичными сайтами связывания дофаминовых рецепторов, которые участвуют в критических клеточных процессах. Это связывание, даже с нейромедиатором дофамином, связанным с дофаминовым рецептором, предотвращает активацию рецептора и передачу нисходящей сигнализации, нарушая развитие личинок, что в конечном итоге приводит к смерти.
Запишите количество невосприимчивых личинок, лишенных движения, в каждой лунке в определенный момент времени после воздействия испытуемого соединения при различных концентрациях соединения.
Повышенная смертность личинок с увеличением концентрации указывает на ларвицидный потенциал исследуемого соединения.
Для начала промаркируйте лунки на прозрачной 24-луночной тканевой культуральной пластине. Используйте аналитические весы для взвешивания исследуемого состава. Затем растворите соединение в стерильной воде двойной дистилляции в пробирке объемом 1,5 миллилитров, в результате чего получится 80-миллимолярный исходный раствор. Далее последовательно разбавляют исходный раствор с помощью дважды дистиллированной воды для приготовления растворов рабочего состава нужных концентраций.
Обратите внимание, что необходимо соблюдать осторожность при добавлении личинок в лунки, во время удаления лишней воды и при добавлении тестовой химии, чтобы избежать физического повреждения личинок. Травма может увеличить смертность и, таким образом, привести к ложноположительным результатам или сделать анализ недействительным.
Используйте пластиковую переводную пипетку с широким отверстием, чтобы перенести пять личинок третьего возраста в каждую лунку планшета. Затем с помощью пипетки объемом 1 миллилитр аккуратно удалите воду и замените ее желаемым объемом воды двойной дистилляции.
Следите за тем, чтобы не задеть личинок при удалении воды. Работайте быстро, чтобы личинки не высыхали, и осторожно добавьте тестовый химикат, пипетируя на противоположной стороне пластиковой лунки.
Добавьте соответствующий объем тестового раствора в каждую лунку и осторожно поворачивайте пластину, чтобы обеспечить равномерное перемешивание. Поместите пластину в камеру для выращивания, поддерживая 12-часовой цикл света и темноты при температуре 25 градусов Цельсия и относительной влажности от 75% до 85%.
Чтобы проверить движение личинок, осторожно постучите по пластине. Если движения не наблюдается, аккуратно прикоснитесь к личинке стерильной зубочисткой. Оцените личинку как мертвую, если не было замечено никакого ответа, и используйте таблицу показателей для записи общего количества мертвых личинок в каждой скважине в моменты времени, описанные в текстовом протоколе.