Анализ активности эндотоксинов: биоанализ на основе хемилюминесценции для исследования активности эндотоксинов в образце крови

У грамотрицательных бактерий эндотоксины липополисахаридов являются жизненно важными компонентами бактериальной наружной мембраны.

Структурно эндотоксин состоит из О-антигена - самой внешней полисахаридной цепи, соединенной через центральное ядро с липидом А, иммуностимулирующим гликолипидом, имеющим решающее значение для активности эндотоксина.

Для исследования активности эндотоксина берут пробирку с подходящим буфером, содержащим антилипидные антитела А, зимозан – экзогенный активатор нейтрофилов, и люминол – хемилюминесцентное средство.

Суспендируйте оптимальный объем инфицированного образца крови, содержащего эндотоксины и клетки крови, включая нейтрофилы. Инкубируйте трубку в физиологических условиях.

Во время инкубации антилипидное антитело А распознает липид-А компонент эндотоксина и связывается с ним через антигенсвязывающие домены, в результате чего образуется комплекс антитело-эндотоксин.

FC-домен связанного с эндотоксином антитела связывается с комплементарным рецептором нейтрофилов, представляя прикрепленные эндотоксины нейтрофилам. Это связывание действует как прайминг стимул для нейтрофилов, запуская их активацию.

Активированные нейтрофилы поглощают зимозан и инициируют иммунный ответ, что приводит к быстрому высвобождению активных форм кислорода, АФК, из нейтрофилов. Эти АФК способствуют окислению люминола, что приводит к излучению света за счет хемилюминесценции.

Интенсивность хемилюминесцентного сигнала соответствует активности эндотоксина в образце крови.

Сначала поместите пробирки EA, которые будут использоваться, в штативы для пробирок и снимите крышки. С помощью комбинированной пипетки переведите 1 миллилитр реагента EA из флакона в пробирки No 1, No 2 и No 3 с помощью пипетирования вниз по боковым сторонам пробирок. Аккуратно переверните пробирку для сбора крови 20 раз, чтобы перемешать образец крови пациента. Затем пипеткой нанесите 0,5 миллилитра крови пациента в пробирку No 4 и пробирку No 5. Вихревая трубка No4 на 10 секунд.

Поместите штативы со всеми пробирками EA в шейкер инкубатора, закройте крышку и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение 10 минут. После этого откройте крышку инкубатора, и снимите штативы для пробирок с шейкера.

Вихревая трубка No5. С помощью стерильного наконечника пипеткой наберите 40 микролитров крови в пробирки No1 и No2, в двух экземплярах.

Вихревая трубка No4. С помощью того же наконечника пипетки переложите 40 микролитров крови из пробирки No4 в пробирку No3, в двух экземплярах.

Закрутите шесть последних пробирок одну за другой. Поместите штативы для пробирок обратно в инкубационный шейкер и закройте крышку. Установите шейкер на 100 об/мин и начните движение на 14 минут.

Вставьте чип-карту с маркировкой EA в хемилюминометр и нажмите «Старт». После 14-минутной инкубации следуйте инструкциям, отображаемым на хемилюминометре. Осторожно смочите каждую пробирку в течение 10 секунд, прежде чем поместить ее на держатель образца хемилюминометра.

Откройте ящик для образцов и поместите пробирку No 1 в держатель для образцов. Затем закройте ящик с образцами и дождитесь показаний относительной единицы света. Повторите этот процесс чтения для трубок 2 и 3, а также для всех дубликатов, как указано в текстовом протоколе.

После того, как все пробирки будут обработаны, результаты EA будут рассчитаны и распечатаны автоматически.

Повторите весь процесс анализа для каждого образца крови, который необходимо исследовать. Набор для анализа EA и его компоненты храните в оригинальной герметичной упаковке при температуре от 2 до 25 градусов Цельсия.