JoVE Encyclopedia of Experiments
Биологические методы
0 просмотров • 4:38 мин • July 8th, 2025
Эндотоксин, грамотрицательный бактериальный токсин, присутствующий на внешней мембране, представляет собой липополисахарид, ЛПС, состоящий в основном из липидов и полисахаридов, включая липид А и О-антиген. При высвобождении во время инфекции он распознается иммунной системой, вызывая воспалительные реакции на основе цитокинов.
Для оценки контаминации эндотоксина в липосомальной лекарственной наноформе с использованием лизата амебоцитов Limulus, LAL, анализ, готовят реакционные пробирки, одна из которых содержит лекарственное средство, а другая содержит лекарственное средство, приправленное известной концентрацией эндотоксина.
Добавьте реагент LAL, содержащий лизат белка, полученный из мечехвоста, Limulus polyphemus, клеток крови или амебоцитов. Лизат включает в себя неактивные сериновые протеазы - фактор В, фактор С, фермент свертывания крови - и гелеобразующий белок коагулоген.
Сделайте трубки вихревыми и загрузите их в мутномер, чтобы измерить мутность растворов.
В присутствии загрязняющего ЛПС, связанного с липосомальными препаратами, ЛПС-чувствительный фактор С автоматически активируется, который затем расщепляет и активирует фактор В, который превращает фермент просвертывания крови в фермент свертывания. Этот активированный фермент расщепляет пептидные связи коагулогена, образуя мономера коагулина.
В конечном счете, мономеры полимеризуются в результате взаимодействия между обнаженными гидрофобными областями на голове и гидрофобным хвостом другого, что приводит к агрегации и образованию нерастворимого мутного геля коагулина. Измеренная мутность помогает определить концентрацию эндотоксина в нанопрепарате.
Рассчитанное восстановление спайков от концентраций эндотоксинов в шипованных и испытуемых образцах в пределах допустимого диапазона указывает на отсутствие существенных помех со стороны нанопрепарата, что подтверждает присутствие эндотоксинов в нанопрепарате.
Для получения калибровочного стандарта используйте 900 микролитров лизата амебоцитов Limulus или воды класса LAL и 100 микролитров контрольного стандартного эндотоксина, чтобы приготовить столько промежуточных разведений, сколько необходимо, чтобы можно было приготовить калибровочный стандарт с концентрацией одна единица эндотоксина на миллилитр.
Затем, используя 900 микролитров воды класса LAL и 100 микролитров одного калибровочного стандарта эндотоксина на миллилитр, готовят второй калибровочный стандарт в концентрации 0,1 эндотоксина-единицы на миллилитр.
Затем повторите последовательное 10-кратное разведение для получения двух более низких калибровочных стандартов, чтобы получить в общей сложности четыре калибровочных стандарта в диапазоне от 0,001 до 1 единицы эндотоксина на миллилитр.
Для приготовления контрольного показателя качества 0,05 эндотоксин-единицы на миллилитр смешайте 50 микролитров одной эндотоксин-единицы на миллилитр контрольного стандартного раствора эндотоксина с 950 микролитрами воды класса LAL.
Затем в программном обеспечении выберите «Настройки инструмента» и создайте шаблон. Выберите «Собирать данные» и введите идентификатор теста и группу данных во вкладке «Общие». На вкладке «Оборудование» выберите тип прибора и метод LAL и убедитесь, что на экране отображается серийный номер, идентификатор системы и информация о последовательном порте.
Нажмите «OK» два раза, чтобы подтвердить выбор прибора и связь с прибором, и введите идентификаторы образцов в том же порядке, в котором будут тестироваться образцы. Затем с помощью кнопок по умолчанию введите отрицательный контроль, стандартную кривую и тестовые образцы.
Добавьте соответствующий объем отрицательных контрольных калибровочных стандартов и стандартов контроля качества в дубликаты предварительно маркированных стеклянных пробирок и добавьте соответствующий объем LAL в первую тестовую пробирку. Кратковременно похлопайте флакон и поместите его в соответствующие тестовые отверстия в карусели инструментов.
Перед загрузкой образцов выполните несколько разведений испытуемого наноматериала в пределах максимально допустимого разведения, как показано на рисунке.